قياس التنفس عالي الدقة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الحيوانات المنوية البشرية

Summary

يسمح تحليل وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية عن طريق قياس التنفس عالي الدقة بقياس استهلاك الأكسجين للحيوانات المنوية المتحركة بحرية في نظام الغرفة المغلقة. يمكن تطبيق هذه التقنية لقياس التنفس في الحيوانات المنوية البشرية ، والتي توفر معلومات عن خصائص الميتوكوندريا المنوية وسلامتها.

Abstract

غالبا ما تتم دراسة جودة السائل المنوي عن طريق تحليل السائل المنوي الروتيني ، وهو وصفي وغالبا ما يكون غير حاسم. يرتبط العقم عند الذكور بنشاط الميتوكوندريا للحيوانات المنوية المتغيرة ، وبالتالي فإن قياس وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية هو مؤشر على جودة الحيوانات المنوية. قياس التنفس عالي الدقة هو طريقة لقياس استهلاك الأكسجين للخلايا أو الأنسجة في نظام الغرفة المغلقة. يمكن تنفيذ هذه التقنية لقياس التنفس في الحيوانات المنوية البشرية وتوفر معلومات حول جودة وسلامة الميتوكوندريا المنوية. يسمح قياس التنفس عالي الدقة للخلايا بالتحرك بحرية ، وهي ميزة مسبقة في حالة الحيوانات المنوية. يمكن تطبيق هذه التقنية مع الحيوانات المنوية السليمة أو المتداخلة وتسمح بدراسة وظيفة الميتوكوندريا المنوية السليمة ونشاط مجمعات السلسلة التنفسية الفردية. تستخدم أداة oxygraph عالية الدقة أجهزة استشعار لقياس تركيز الأكسجين إلى جانب برامج حساسة لحساب استهلاك الأكسجين. تستخدم البيانات لحساب مؤشرات الجهاز التنفسي بناء على نسب استهلاك الأكسجين. وبالتالي ، فإن المؤشرات هي نسب معدلين لاستهلاك الأكسجين ويتم تطبيعها داخليا إلى عدد الخلايا أو كتلة البروتين. مؤشرات الجهاز التنفسي هي مؤشر على وظيفة الميتوكوندريا المنوية والخلل الوظيفي.

Introduction

يقدر أن العقم عند الذكور يمثل 40٪ -50٪ من جميع حالات العقم عند الأزواج¹. يلعب تحليل السائل المنوي التقليدي دورا حاسما في تحديد خصوبة الذكور. ومع ذلك ، فإن ما يقرب من 15 ٪ من الرجال المصابين بالعقم لديهم معايير الحيوانات المنوية الطبيعية². بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تحليل السائل المنوي الروتيني معلومات محدودة حول وظيفة الحيوانات المنوية ولا يعكس عيوب الحيوانات المنوية الدقيقة³.

الميتوكوندريا المنوية لها بنية خاصة ، حيث يتم ترتيبها كغمد حلزوني حول السوط. يحتوي غمد الميتوكوندريا على عدد متغير من الميتوكوندريا المتصلة بواسطة روابط بين الميتوكوندريا ومثبتة على الهيكل الخلوي عن طريق ترتيبات البروتين المطلوبة على غشاء الميتوكوندريا الخارجي ^4,5. هذا التركيب يجعل من الصعب بشكل خاص عزل الميتوكوندريا المنوية. لذلك ، فإن معظم الدراسات حول وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية تستخدم التحليلات في الموقع أو الحيوانات المنوية^{المفككة 6}.

تم ربط بنية الميتوكوندريا المنوية ووظيفتها باستمرار بالعقم عند الذكور⁷،^8،9،¹⁰،^{11 ،} مما يشير إلى أن تحليل بنية ووظيفة هذه العضيات قد يكون مرشحا جيدا لإدراجها في تحليل الحيوانات المنوية.

تلعب الميتوكوندريا دورا مهما في استقلاب الطاقة الخلوية ، لا سيما باستخدام الأكسجين لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS). في الحيوانات المنوية ، على وجه الخصوص ، مصدر ATP (تحلل السكر مقابل OXPHOS) متنازع عليه ، ولا يزال الكثير من البيانات مثيرا للجدل ويعتمد على مناهج تجريبية مختلفة⁴،^12،13. تقدم قياسات التنفس عن طريق قياس التأكسج رؤى مهمة حول القدرة التنفسية للميتوكوندريا ، وسلامة الميتوكوندريا ، واستقلاب الطاقة للخلية¹⁴،^15،16. تقليديا ، تم تنفيذ هذه التقنية باستخدام قطب الأكسجين كلارك - أداة تم استخدامها لقياس تنفس الميتوكوندريا لأكثر من 50 عاما^17,18. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا المنوية باستخدام قطب الأكسجين الكلاسيكي^{كلارك 19}،^20،21. يوفر قياس التنفس عالي الدقة (HRR) باستخدام أجهزة الأوكسجين (Oroboros) حساسية أعلى من استخدام أجهزة قياس التنفس الكلاسيكية²². تتكون أجهزة الأوكسجين من غرفتين مع منافذ حقن ، وتحتوي كل غرفة على مستشعر أكسجين بولاروغرافي. باستخدام هذه التقنية ، من الممكن تحليل شرائح الأنسجة والخلايا ومعلقات الميتوكوندريا المعزولة. يتم تحريك العينة باستمرار في الغرفة ، وخلال التجربة ، يتم قياس استهلاك الأكسجين ، ويتم حساب معدلات الأكسجين باستخدام برنامج محدد. تظهر الغرف انخفاضا في تسرب الأكسجين ، وهي ميزة على أجهزة قطب الأكسجين التقليدية^14,23.

كما هو الحال مع الخلايا الأخرى ، في حالة الحيوانات المنوية ، تكون حساسية معدات HRR أعلى من قياس التنفس التقليدي ، مما يعني أنه يمكن استخدام معدات HRR لتحليل عدد محدود من خلايا الحيوانات المنوية السليمة أو المتخللة. هناك استراتيجيتان رئيسيتان لتقييم وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية بواسطة HRR: (أ) قياس استهلاك الأكسجين في الخلايا السليمة ، والذي يتضمن إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في وسط يحتوي على ركائز مثل الجلوكوز ، أو (ب) قياس استهلاك الأكسجين في الخلايا النفاذية باستخدام أحد معقدات OXPHOS ، مع إضافة ركائز محددة لمراقبة كل وظيفة على حدة.

في هذه الدراسة ، وصفنا استخدام HRR لتحديد تنفس الميتوكوندريا في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لكلية الطب بجامعة الجمهورية ، مونتيفيديو ، أوروغواي.

الشكل 1: سير عمل قياس التنفس عالي الدقة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الحيوانات المنوية البشرية السليمة والنفاذة. تم تقسيم البروتوكول إلى أربع خطوات مختلفة: 1) تحضير العينة ، 2) معايرة الأكسجين في أداة Oroboros ، 3) قياس استهلاك الأكسجين للخلايا السليمة والمتخللة ، و 4) استخراج البيانات من المعدات والتحليل. الاختصارات: CASA = تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر. BWW = بيجرز ويتن ويتنغهام متوسطة ؛ MRM = وسط تنفس الميتوكوندريا. ADP = أدينوسين ثنائي الفوسفات. FCCP = سيانيد الكربونيل -p- ثلاثي فلورو روميثوكسي فينيل هيدرازون ؛ AA = مضاد الميسين أ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملاحظة: يظهر سير العمل لقياس استهلاك الأكسجين في خلايا الحيوانات المنوية باستخدام HRR في الشكل 1. يتم تقديم معلومات حول المواد والمعدات والكواشف المستخدمة في البروتوكول في جدول المواد.

1. إعداد العينة

1. جمع العينات
   1. جمع السائل المنوي البشري المقذوف حديثا عن طريق الاستمناء بعد الامتناع عن ممارسة الجنس لمدة 3 أيام في حاوية بلاستيكية معقمة. نقل العينات على الفور إلى المختبر.
   2. احتضان العينات لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتسييل²⁴ تماما.
   3. بعد التسييل ، قم بتخزين العينات في درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تبدأ التجربة.
2. تقييم الحيوانات المنوية باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA)
   1. امزج العينة ، وقم بتحميل 7 ميكرولتر في غرفة عد الحيوانات المنوية التي تم تسخينها مسبقا.
   2. ضع الحجرة على مرحلة التسخين المسبق (37 درجة مئوية) من المجهر الضوئي المباشر.
   3. افتح برنامج تحليل الحيوانات المنوية المحوسب ، وأدخل وحدة الحركة والتركيز (انقر فوق Mot).
   4. حدد التكوين الذي يتوافق مع ظروف الحيوانات المنوية البشرية.
      ملاحظة: يجب تكييف التكوين مع نوع وعمق الغرفة وكذلك مع أنواع العينات ونظام CASA.
   5. قم بتحليل 10 حقول مختلفة لكل غرفة بشكل عشوائي بالنقر فوق الزر "تحليل ".
   6. انقر فوق النتائج للحصول على تركيز العينة وحركتها.
3. إعداد الخلية
   ملاحظة: إذا لم تتم معايرة HRR ، فابدأ بالخطوات 2.1-2.2 قبل تحضير الخلايا (الخطوة 1.3). من المهم قياس استهلاك الأكسجين فورا عند إعادة تعليق خلايا الحيوانات المنوية في الوسط.
   1. أجهزة الطرد المركزي العينات في 400 × غرام لمدة 10 دقائق في RT.
   2. إزالة البلازما المنوية ، وإعادة تعليق الحيوانات المنوية في 2 مل من Biggers Whitten Whittingham (BWW) لإجراء تجارب على الخلايا السليمة أو وسط التنفس الميتوكوندريا (MRM) للدراسات مع الخلايا النفاذية. يتم عرض تركيبات الوسائط في الجدول 1.
   3. كرر الخطوات الموضحة في الخطوة 1.2 لدراسات تركيز الحيوانات المنوية.

2. قياس التنفس عالي الدقة: تحليل OXPHOS

ملاحظة: يدمج HRR أجهزة الأوكسجين عالية الحساسية (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH، إنسبروك، النمسا) مع برنامج (DatLab, version 4.2; أوروبوروس إنسترومنتس جي إم بي إتش). يتم عرض البيانات التجريبية على أنها تركيز الأكسجين مقابل الوقت (مثل pmol ل O₂/10⁶ خلايا · min⁻¹) وكتحولات في الوقت الفعلي لهذه البيانات ، مما يسمح للمجرب بتتبع التنفس (استهلاك الأكسجين ، تدفق الأكسجين) للعينات البيولوجية والكيميائية الحيوية بينما لا تزال التجربة جارية. يمكن استخدام HRR لمتابعة تنفس الخلايا الحية والمتحركة ، وهو أمر مفيد بشكل خاص للحيوانات المنوية ، التي ترتبط حركتها بجودة الحيوانات المنوية وإمكانات الخصوبة. يستخدم المختبر HRR Oroboros Oxygraph2-k ، أدوات Oroboros ، مع غرفتين. يجب تنفيذ الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول بشكل مستقل لكل من غرف 2 مل.

1. إعداد المعدات
   1. قم بتشغيل HRR ، وقم بتوصيله ببرنامج قياس التنفس (DatLab) للحصول على البيانات وتحليلها.
   2. استبدل الإيثانول بنسبة 70٪ في غرفة الأوكسيجراف ب ddH₂O. حركه باستمرار باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي في الحجرة عند 750 دورة في الدقيقة. اتركه لمدة 10 دقائق ، واستنشق H₂O المقطر المزدوج (dd) بعد ذلك.
   3. اغسل الحجرة ثلاث مرات باستخدام ddH₂O لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة الإيثانول المتبقي من الغرف. خلايا الحيوانات المنوية حساسة للغاية للإيثانول. يمكن اختراق التسجيل إذا تم حذف هذه الخطوة.
2. معايرة مستشعرات الأكسجين
   ملاحظة: يختلف إجراء المعايرة قليلا حسب الجهاز. قم بإجراء معايرة الهواء لمستشعر الأكسجين البولوجرافي كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة²⁵. في هذا القسم ، يتم شرح بروتوكول المعايرة بإيجاز.
   1. قم بإزالة ddH 2 O ، وماصة₂مل من نفس الوسط المستخدم لإعداد الخلية في الغرفة. ضع السدادات ، تاركا فقاعة تبادل الهواء.
      ملاحظة: من المهم معرفة حجم الغرفة لتحديد الحجم الدقيق للوسط المطلوب.
   2. سجل قيم معايرة الأكسجين (انقر فوق تخطيط > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) لمراقبة أداء غشاء المستشعر عن طريق تحريك الوسط بقضيب التحريك عند 750 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. استخدم الإعدادات الأخرى كما ذكر: كسب المستشعر: 2 ؛ جهد الاستقطاب: 800 مللي فولت ؛ الفاصل الزمني لتسجيل البيانات: 2.0 ثانية.
      ملاحظة: من المتوقع الحصول على منحدر O 2 غير مصحح (خط أحمر) ضمن ±₂ pmol∙s−1∙^mL−1 مع إشارة مستقرة من مستشعر البولاروغرافيا.
   3. اسحب الماوس أثناء الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر ومفتاح shift لتحديد منطقة يكون فيها التغيير في تركيز الأكسجين (تركيز Y1 O2 ، الخط الأزرق) مستقرا.
   4. افتح نافذة معايرة O₂ (انقر فوق Oxygraph > معايرة O2). في معايرة الهواء، قم بتغيير العلامة المحددة إلى المنطقة المحددة في الخطوة 2.2.3. قم بإنهاء بالنقر فوق معايرة ونسخ إلى الحافظة.
   5. أوقف التسجيل واحفظه بالنقر فوق Oxygraph > Ok Control > حفظ وقطع الاتصال.
      ملاحظة: يجب حفظ مجموعة البيانات هذه بحيث يمكن استخدامها في جميع تجارب اليوم. يتم إجراء المعايرة مرة واحدة فقط يوميا لكل وسيط.
3. معايرة نفاذية الديجيتونين
   1. افتح الغرفة ، واستنشق الوسط من الداخل.
   2. تحميل في الغرفة على الأقل 24 × 10 6 وليس أكثر من 70 × 10⁶ خلايا الحيوانات المنوية في حجم نهائي من 2 مل من MRM.
      ملاحظة: من المهم قياس عدد الخلايا في الغرفة من أجل ضبط استهلاك الأكسجين في نهاية التجربة. لا يمكن قياس عدد أقل من الخلايا عن الموصى به.
   3. أغلق الحجرة عن طريق دفع السدادات بالكامل ، واستنشاق السائل المتبقي في الأعلى. ابدأ التجربة بنفس إعدادات المعايرة: سرعة التحريك: 750 دورة في الدقيقة ؛ درجة الحرارة: 37 °C ؛ كسب للمستشعر: 2 ؛ جهد الاستقطاب: 800 مللي فولت ؛ والفاصل الزمني لتسجيل البيانات: 2.0 ثانية.
   4. لتحميل المعايرة ، انقر نقرا مزدوجا فوق مربع Pos Calib في الزاوية السفلية. افتح المعايرة التي تم إجراؤها في الخطوة 2.2 (انقر فوق Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) ، وانقر فوق معايرة ونسخ إلى الحافظة.
      ملاحظة: سيتغير صندوق نقاط البيع كاليب من الأصفر إلى الأخضر. يتم عرض البيانات في تدفق الأكسجين المصحح لكل مخططات الحجم (التخطيط 05 تدفق لكل وحدة تخزين غير مصحح). تتوفر تخطيطات مختلفة في تخطيط > Oxygraph.
   5. أضف 5 ميكرولتر من 0.5 M أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) ، 10 ميكرولتر من 2 M الغلوتامات ، و 2.5 ميكرولتر من 0.4 M malate (التركيزات النهائية: 1.25 mM ، 10 mM ، و 0.5 mM). قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تستقر الإشارة.
      ملاحظة: تستخدم محاقن هاملتون الدقيقة الدقيقة للحقن من خلال منفذ التحميل في السدادة. استخدم حقنة واحدة لكل دواء لتجنب التلوث المتبادل. انقر فوق F4 للتسجيل ، وقم بالإشارة في سجل الأكسجين عند إضافة العلاج.
      ملاحظة: يتم تحضير الركائز في ماء عالي النقاء وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
   6. تريت بإضافة 1 ميكرولتر من 10 مللي متر ديجيتونين في خطوات متتالية حتى يصل استهلاك الأكسجين إلى الحد الأقصى.
      ملاحظة: يعد الغسيل الشامل بالماء و 70٪ إيثانول و 100٪ إيثانول أمرا ضروريا إذا تم استخدام نفس الغرفة لإجراء تجربتين في نفس اليوم.
      ملاحظة: يتم تحضير الديجيتونين في ماء عالي النقاء وتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
4. بروتوكول التقييم التنفسي الروتيني للحيوانات المنوية السليمة والمتخللة (المركب الأول أو المعقد الثاني)
   1. افتح الغرفة ، واستنشق الوسط من الداخل.
   2. تحميل في الغرفة على الأقل 24 × 10 6 وليس أكثر من 70 × 10⁶ خلايا الحيوانات المنوية في حجم نهائي من 2 مل من BWW (تحليل الخلايا السليمة) أو MRM (تحليل الخلايا النفاذية).
   3. ابدأ التجربة بنفس إعدادات المعايرة (هذا موضح في الخطوة 2.3.3).
   4. قم بتحميل المعايرة التي تم إجراؤها في الخطوة 2.2 كما هو موضح في الخطوة 2.3.4.
   5. سجل تنفس الخلايا لمدة 5 دقائق على الأقل حتى يتم الحصول على إشارة مستقرة. يتوافق هذا القياس مع التنفس القاعدي في الخلايا السليمة.
   6. إذا كانت التجربة مع خلايا سليمة، فانتقل إلى الخطوة 2.4.9. للخلايا النفاذية ، حقن 4.5 ميكرولتر من 10 مللي متر ديجيتونين (التركيز النهائي: 22.5 ميكرومتر). تتخلل الخلايا لمدة 5 دقائق.
   7. أضف الركائز: 10 ميكرولتر من 2 M الغلوتامات و 2.5 ميكرولتر من 0.4 M malate (التركيزات النهائية: 10 mM و 0.5 mM ، على التوالي) للمركب I أو 20 μL من 1 M succinate (التركيز النهائي: 10 mM) للمركب II. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تزداد الإشارة وتستقر . هذه هي الحالة 4، وهو ما يعني أن المركب القاعدي I أو المركب القاعدي II يدعم التنفس في غياب جزيء ADP .
      ملاحظة: يتم تحضير الركائز في ماء عالي النقاء وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
   8. حقن 5 ميكرولتر من 0.5 M ADP (التركيز النهائي: 1.25 mM). قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تزداد الإشارة وتستقر . تؤدي إضافة ADP إلى زيادة الإشارة المقابلة للحد الأقصى لاستهلاك الأكسجين من خلال المركب I أو المعقد II (الحالة 3 ، في الخلايا المتداخلة).
   9. أضف 1 ميكرولتر من 4 ملغ / مل oligomycin (التركيز النهائي: 2 ميكروغرام / مل) ، مثبط ATP synthetase. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تنخفض الإشارة وتستقر .
      ملاحظة: يتم تحضير Oligomycin في الإيثانول وتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
   10. قم بالمعايرة بإضافة 1 ميكرولتر من 0.1 mM إلى 1 mM كربونيل سيانيد-P- ثلاثي فلورو روميثوكسي-فينيل هيدرازون (FCCP) في خطوات متتالية حتى يتم الوصول إلى أقصى معدل تنفس غير مقترن. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تزداد الإشارة وتستقر .
       ملاحظة: يتم تحضير FCCP في الإيثانول وتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
   11. يعتمد التركيز النهائي ل FCCP على العينة. توقف عن حقن الدواء عندما يبدأ استهلاك الأكسجين في الانخفاض.
   12. أخيرا ، حقن 1 ميكرولتر من 5 mM antimycin A (2.5 μM التركيز النهائي). هذا مثبط معقد III للتمييز بين استهلاك الميتوكوندريا والأكسجين المتبقي (التنفس غير الميتوكوندريا). لتحليل المركب I ، أضف 1 ميكرولتر من 1 mM rotenone (0.5 μM التركيز النهائي) ، وهو مثبط لهذا المركب ، بدلا من AA. قم بقياس استهلاك الأكسجين حتى تنخفض الإشارة وتستقر .
       ملاحظة: يتم تحضير الأدوية في الإيثانول وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.

3. استخراج البيانات وتحليلها

الشكل 2: اكتساب معلمات تنفسية من تجربة قياس التنفس عالية الاستبانة. (أ ، ب) التمثيلات التخطيطية للرسوم البيانية التي تم الحصول عليها ، كما هو موضح في الشكل 1 ، للخلايا السليمة والمتخلصة ، على التوالي. تم وصف هذه المعلمات سابقا¹⁵. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. اسحب الماوس عن طريق الضغط على زر الماوس الأيسر ومفتاح shift لتحديد المناطق التي يرتبط فيها تدفق الأكسجين لكل وحدة تخزين (Y2 O2 المنحدر uncorr. ، الخط الأحمر) مستقرا بعد حقن الركيزة أو المانع. ويبين الشكل 2 البارامترات المختلفة التي تم الحصول عليها من السجل الموصوف سابقا¹⁵.
   ملاحظة: تعتمد المعلمات على التجربة ؛ كلها على النحو التالي: التنفس القاعدي في الخلايا السليمة والتنفس في وجود الغلوتامات / مالات أو سكسينات (الحالة 4) ، ADP (الحالة 3) ، oligomycin (تسرب البروتون) ، FCCP (أقصى معدل للتنفس) ، روتينون / AA (التنفس غير الميتوكوندريا). في الخلايا النفاذية ، يتوافق التنفس القاعدي مع الحالة 3.
2. انقر فوق نوافذ العلامات > الإحصائيات ، وقم بتصدير البيانات.
3. تطبيع البيانات التي تم الحصول عليها لكل 1 مليون خلية منوية. وحدات المنحدرات هي pmolO₂ · s − ¹ · ^{mL − 1} · 10⁻⁶ خلايا.
4. اطرح استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا من جميع القيم قبل حساب المؤشرات.
5. احسب المؤشرات باستخدام المعادلات المختلفة الموضحة سابقا¹⁵:
   

النتائج

تحديد التركيز الأمثل للديجيتونين في خلايا الحيوانات المنوية
في هذا البروتوكول ، نقدم استخدام HRR لمراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في OXPHOS في خلايا الحيوانات المنوية البشرية. نظرا لأنه يمكن استخدام الطريقة لتحليل الحيوانات المنوية السليمة أو النفاذة للديجيتونين ، فإننا نقدم أول...

Discussion

يعتمد HRR بشكل حاسم على عدة خطوات: (أ) صيانة المعدات ، (ب) المعايرة الدقيقة لأجهزة استشعار الأكسجين ، (ج) معايرة جهاز فك^{التوصيل 26} ، وأخيرا ، (د) الاستخدام المناسب للمؤشرات التي تمثل وظيفة الميتوكوندريا. صيانة المعدات أمر بالغ الأهمية. يوصى باستبدال أغشية مستشعر الأكسجين البولاروغ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700