高分辨率呼吸测定法评估人类精子的线粒体功能

摘要

通过高分辨率呼吸测定法分析精子线粒体功能，可以测量密闭腔系统中自由移动的精子的耗氧量。该技术可用于测量人类精子的呼吸，从而提供有关精子线粒体特征和完整性的信息。

摘要

精液质量通常通过常规精液分析进行研究，常规精液分析是描述性的，通常没有定论。男性不育症与精子线粒体活性的改变有关，因此精子线粒体功能的测量是精子质量的指标。高分辨率呼吸测量法是一种测量密闭腔系统中细胞或组织耗氧量的方法。该技术可用于测量人类精子的呼吸，并提供有关精子线粒体质量和完整性的信息。高分辨率呼吸测量法允许细胞自由移动，这在精子的情况下是一个 先验 的优势。该技术可以应用于完整或透化的精子，并允许研究完整的精子线粒体功能和单个呼吸链复合物的活性。高分辨率氧谱仪使用传感器测量氧气浓度，并结合灵敏的软件来计算氧气消耗量。这些数据用于根据耗氧率计算呼吸指数。因此，这些指数是两种耗氧率的比例，并在内部归一化为细胞数量或蛋白质质量。呼吸指数是精子线粒体功能和功能障碍的指标。

引言

据估计，男性不育症占夫妻不育症病例的 40%-50%¹。传统的精液分析在确定男性生育能力方面起着至关重要的作用;然而，大约 15% 的不育男性具有正常的精子参数².此外，常规精液分析提供的精子功能信息有限，不能反映细微的精子缺陷³.

精子线粒体具有特殊的结构，因为它们在鞭毛周围排列成螺旋鞘。线粒体鞘包含数量不等的线粒体，线粒体通过线粒体间连接子连接，并通过线粒体外膜上的有序蛋白质排列锚定在细胞骨架上 ^4,5。这种结构使得分离精子线粒体特别困难。因此，大多数精子线粒体功能研究都使用原位分析或脱膜精子⁶。

精子线粒体结构和功能一直与男性不育症有关7,8,9,10,11^，这表明对这些细胞器的结构和功能的分析可能是纳入精子分析的良好候选者。

研究方案

这些实验得到了乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院伦理委员会的批准。

图 1：高分辨率呼吸测量法评估完整和透化人类精子中线粒体功能的工作流程。 该协议分为四个不同的步骤：1）样品的制备，2）Oroboros仪器中的氧气校准，3）完整和透化细胞的耗氧量测量，以及4）从设备中提取数据和分析。缩写：CASA = 计算机辅助精子分析;BWW = Biggers Whitten Whittingham 中等;MRM = 线粒体呼吸介质;ADP = 二磷酸腺苷;FCCP=羰基氰-p-三氟甲氧基苯腙;AA = 抗霉素 A. 请点击这里查看此图的较大版本.

注：使用HRR测量精子细胞耗氧量的工作流程如图

讨论

HRR 主要取决于几个步骤：（a） 设备维护，（b） 氧传感器的精确校准，（c） 解偶联滴定²⁶，最后，（d） 充分使用代表线粒体功能的指数。设备维护至关重要。建议定期更换极谱法氧传感器的膜，并校正仪器背景。从腔室收集精子后进行大量洗涤对于获得良好的重复至关重要，尤其是在仪器经常用于分析各种组织或细胞的实验室中。精子对少量鱼藤酮、AA、寡霉素和FCCP敏感，?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700