רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

Summary

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

Abstract

איכות הזרע נלמדת לעתים קרובות על ידי ניתוח זרע שגרתי, שהוא תיאורי ולעתים קרובות לא חד משמעי. אי פוריות הגבר קשורה לשינוי בפעילות המיטוכונדריה של הזרע, ולכן מדידת תפקוד המיטוכונדריה של הזרע היא אינדיקטור לאיכות הזרע. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה היא שיטה למדידת צריכת החמצן של תאים או רקמות במערכת תא סגור. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי למדוד נשימה בזרע אנושי ומספקת מידע על האיכות והשלמות של מיטוכונדריית הזרע. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשרת לתאים לנוע בחופשיות, וזה יתרון מראש במקרה של זרע. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עם זרעונים שלמים או חדירים, ומאפשרת ללמוד את תפקוד המיטוכונדריה של זרע שלם ואת הפעילות של מתחמי שרשרת נשימה בודדים. מכשיר האוקסיגרף ברזולוציה גבוהה משתמש בחיישנים כדי למדוד את ריכוז החמצן יחד עם תוכנה רגישה כדי לחשב את צריכת החמצן. הנתונים משמשים לחישוב מדדי נשימה המבוססים על יחסי צריכת החמצן. כתוצאה מכך, המדדים הם הפרופורציות של שני שיעורי צריכת חמצן והם מנורמלים פנימית למספר התא או מסת החלבון. מדדי הנשימה הם אינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי זרע ולתפקוד לקוי.

Introduction

על פי הערכות, אי פוריות הגבר מהווה 40%-50% מכלל מקרי אי הפוריות בזוגות¹. ניתוח זרע קונבנציונלי ממלא תפקיד מכריע בקביעת פוריות הגבר; עם זאת, לכ -15% מהגברים העקרים יש פרמטרים זרע תקינים². בנוסף, ניתוח זרע שגרתי מספק מידע מוגבל על תפקוד הזרע ואינו משקף פגמים עדינים^{בזרע 3}.

למיטוכונדריה של זרע יש מבנה מיוחד, מכיוון שהם מסודרים כנדן סלילי סביב השוטון. מעטפת המיטוכונדריה מכילה מספר משתנה של מיטוכונדריה המחוברים על ידי מקשרים אינטרמיטוכונדריאליים ומעוגנים לשלד הציטוכונדריאלי על ידי סידורי חלבון מסודרים על קרום המיטוכונדריה^{החיצוני 4,5}. מבנה זה מקשה במיוחד על בידוד מיטוכונדריית זרע. לכן, רוב המחקרים על תפקוד מיטוכונדריאלי של זרע משתמשים באנליזות ממוקדות או זרע דממברני⁶.

המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה של הזרע נקשרו באופן עקבי לאי פוריות הגבר 7,8,9,10,11^, דבר המצביע על כך שניתוח המבנה והתפקוד של אברונים אלה עשוי להיות מועמד טוב להכללה בניתוח זרע.

מיטוכונדריה ממלאים תפקיד חשוב במטבוליזם של אנרגיה תאית, במיוחד על-ידי שימוש בחמצן לייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS). בזרעונים, בפרט, המקור של ATP (גליקוליזה לעומת OXPHOS) שנוי במחלוקת, וחלק גדול מהנתונים נותר שנוי במחלוקת ותלוי בגישות ניסיוניות שונות 4,12,13. מדידות של נשימה על ידי אוקסימטריה מציעות תובנות משמעותיות לגבי קיבולת הנשימה של המיטוכונדריה, שלמות המיטוכונדריה ומטבוליזם האנרגיה של התא^14,15,16. באופן מסורתי, טכניקה זו בוצעה באמצעות אלקטרודת חמצן קלארק - מכשיר המשמש למדידת נשימה מיטוכונדריאלית במשך יותר מ -50 שנה^17,18. בנוסף, צריכת החמצן במיטוכונדריה של הזרע נותחה באמצעות אלקטרודת החמצן הקלאסית Clark 19,20,21. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) באמצעות אוקסיגרפים (Oroboros) מספקת רגישות גבוהה יותר מאשר שימוש במכשירי רספירומטריה קלאסיים²². האוקסיגרפים מורכבים משני תאים עם יציאות הזרקה, ולכל תא יש חיישן חמצן פולרוגרפי. בעזרת טכניקה זו ניתן לנתח שקופיות רקמות, תאים ותרחיפים מיטוכונדריאליים מבודדים. הדגימה מעורבבת ללא הרף בתא, ובמהלך הניסוי נמדדת צריכת החמצן, ושיעורי החמצן מחושבים באמצעות תוכנה ספציפית. התאים מראים דליפת חמצן מופחתת, המהווה יתרון על פני מכשירי אלקטרודות חמצן קונבנציונליים ^14,23.

כמו בתאים אחרים, במקרה של זרעונים, הרגישות של ציוד HRR גבוהה יותר מאשר עבור רספירומטריה קונבנציונלית, כלומר ציוד HRR יכול לשמש לניתוח של מספר מוגבל של תאי זרע שלמים או חדירים. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות להערכת תפקוד מיטוכונדריית הזרע על ידי HRR: (א) מדידת צריכת החמצן בתאים שלמים, הכוללת שכפול תפקוד הנשימה בתווך המכיל מצעים כגון גלוקוז, או (ב) מדידת צריכת החמצן בתאים חדירתיים באמצעות אחד ממתחמי OXPHOS, עם תוספת מצעים ספציפיים לניטור כל פונקציה בנפרד.

במחקר הנוכחי אנו מתארים את השימוש ב-HRR כדי לקבוע נשימה מיטוכונדריאלית בתאי זרע אנושיים.

Protocol

הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של Facultad de Medicina de la Universidad de la República, מונטווידאו, אורוגוואי.

איור 1: זרימת עבודה עבור רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרע אנושי שלם וחדיר. הפרוטוקול חולק לארבעה שלבים שונים: 1) הכנת הדגימה, 2) כיול חמצן במכשיר האורובורוס, 3) מדידת צריכת חמצן לתאים שלמים וחדירים, 4) הפקת נתונים מהציוד וניתוח. קיצורים: CASA = ניתוח זרע בעזרת מחשב; BWW = Biggers Whitten Whittingham בינוני; MRM = מדיום נשימה מיטוכונדריאלי; ADP = אדנוזין דיפוספט; FCCP = קרבוניל ציאניד -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone; AA = אנטימיצין A. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: זרימת העבודה למדידת צריכת החמצן בתאי זרע באמצעות HRR מוצגת באיור 1. מידע על החומרים, הציוד והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול מוצג בטבלת החומרים.

1. הכנת מדגם

1. אוסף דוגמאות
   1. אסוף זרע אנושי שנפלט טרי על ידי אוננות לאחר התנזרות מומלצת של 3 ימים במיכל פלסטיק סטרילי. להעביר את הדגימות מיד למעבדה.
   2. לדגור על הדגימות במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לנזול לחלוטין²⁴.
   3. לאחר הנזלה, לאחסן את הדגימות ב 37 ° C עד תחילת הניסוי.
2. הערכת זרע באמצעות ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA)
   1. ערבבו את הדגימה והעמיסו 7 μL לתוך תא ספירת זרע שחומם מראש.
   2. הניחו את התא על שלב שחומם מראש (37°C) של מיקרוסקופ אור ישיר.
   3. פתח את תוכנת ניתוח הזרע הממוחשבת והזן את מודול התנועתיות והריכוז (לחץ על Mot).
   4. בחר את התצורה המתאימה לתנאי זרע אנושיים.
      הערה: יש להתאים את התצורה לסוג ולעומק התא, כמו גם למיני הדגימה ולמערכת CASA.
   5. נתח באופן אקראי 10 שדות שונים לכל תא על ידי לחיצה על כפתור ניתוח .
   6. לחץ על תוצאות כדי לקבל את ריכוז הדגימה ואת תנועתיותה.
3. הכנת תאים
   הערה: אם HRR אינו מכויל, התחל בשלבים 2.1-2.2 לפני הכנת התאים (שלב 1.3). חשוב למדוד את צריכת החמצן מיד כאשר תאי הזרע מושהים מחדש בתווך.
   1. צנטריפוגה את הדגימות ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
   2. הסר את פלסמת הזרע, והשהה מחדש את הזרעונים ב -2 מ"ל של Biggers Whitten Whittingham (BWW) לניסויים עם תאים שלמים או מדיום נשימה מיטוכונדריאלי (MRM) למחקרים עם תאים חדירים. הרכבי המדיה מוצגים בטבלה 1.
   3. חזור על השלבים המתוארים בשלב 1.2 עבור מחקרי ריכוז זרע.

2. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה: ניתוח OXPHOS

הערה: HRR משלב אוקסיגרפים רגישים מאוד (אוקסיגרף 2 K; Oroboros Instruments GmbH, אינסברוק, אוסטריה) עם תוכנה (DatLab, גרסה 4.2; Oroboros מכשירים GmbH). נתוני הניסוי מוצגים כריכוז חמצן לעומת זמן (כ-pmol של O₂/10⁶ תאים^·min−1) וכטרנספורמציות בזמן אמת של נתונים אלה, המאפשרים לנסיין לעקוב אחר הנשימה (צריכת חמצן, שטף חמצן) של דגימות ביולוגיות וביוכימיות בזמן שהניסוי עדיין פועל. HRR יכול לשמש כדי לעקוב אחר הנשימה של תאים חיים תנועתיים, אשר שימושי במיוחד עבור זרע, אשר תנועתיות קשורה באיכות הזרע ואת פוטנציאל הפוריות. המעבדה משתמשת HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, עם שני תאים. השלבים המתוארים בפרוטוקול זה חייבים להתבצע באופן עצמאי עבור שני תאים 2 מ"ל.

1. הכנת ציוד
   1. הפעל את HRR וחבר אותו לתוכנת הספירומטריה (DatLab) לצורך איסוף וניתוח נתונים.
   2. החלף את האתנול 70% בתא האוקסיגרף ב- ddH₂O. ערבב אותו ברציפות עם פס הערבוב המגנטי בתא במהירות 750 סל"ד. תן לו לעמוד במשך 10 דקות, ולשאוף את זיקוק כפול (dd) H₂O לאחר מכן.
   3. שטפו את התא שלוש פעמים עם ddH₂O במשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: שלב זה נחוץ כדי להסיר את האתנול שנותר מן החדרים. תאי זרע רגישים מאוד לאתנול. ההקלטה עלולה להיפגע אם שלב זה יושמט.
2. כיול חיישני החמצן
   הערה: הליך הכיול משתנה מעט בהתאם למכשיר. בצע כיול אוויר של חיישן החמצן הפולרוגרפי כמתואר על-ידי היצרן²⁵. בחלק זה, פרוטוקול הכיול מוסבר בקצרה.
   1. הסר את ddH 2 O, פיפטה₂מ"ל של אותו מדיום המשמש להכנת התא לתוך התא. מניחים את הפקקים, ומשאירים בועת חילופי אוויר.
      הערה: חשוב לדעת את נפח התא כדי לקבוע את הנפח המדויק של המדיום הדרוש.
   2. רשום את ערכי כיול החמצן (לחץ על פריסה > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) כדי לפקח על ביצועי קרום החיישן על ידי ערבוב המדיום עם מוט הערבוב ב-750 סל"ד למשך 30 דקות לפחות ב-37°C. השתמש בהגדרות האחרות כאמור: רווח לחיישן: 2; מתח קיטוב: 800 mV; מרווח הקלטת נתונים: 2.0 שניות.
      הערה: הוא צפוי לקבל שיפוע O 2 לא מתוקן (קו אדום) בתוך ±₂ pmol∙s−1∙mL⁻¹ עם אות יציב מהחיישן הפולרוגרפי.
   3. גרור את העכבר תוך לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי ועל מקש Shift כדי לבחור אזור שבו השינוי בריכוז החמצן (ריכוז O2 Y1, קו כחול) יציב.
   4. פתח את חלון כיול O₂ (לחץ על Oxygraph > O2 Calibration). בכיול אוויר, שנה את הסימון שנבחר לאזור שנבחר בשלב 2.2.3. סיים על ידי לחיצה על כיול והעתק ללוח.
   5. עצור את ההקלטה ושמור על ידי לחיצה על Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      הערה: יש לשמור מערך נתונים זה כדי שניתן יהיה להשתמש בו בכל הניסויים של היום. הכיול מתבצע רק פעם ביום עבור כל מדיום.
3. טיטרציה Digitonin-permeabilization
   1. פתחו את החדר, ושאפו את המדיום שבתוכו.
   2. עומס בתא לפחות 24 x 10⁶ ולא יותר מ 70 x 10⁶ תאי זרע בנפח סופי של 2 מ"ל של MRM.
      הערה: חשוב למדוד את מספר התאים בתא על מנת להתאים את צריכת החמצן בסוף הניסוי. לא ניתן למדוד מספר תאים נמוך מהמומלץ.
   3. סגרו את התא על ידי דחיפת הפקקים כל הדרך פנימה, ושאפו את הנוזל שנותר בחלק העליון. התחל את הניסוי עם אותן הגדרות כמו עבור הכיול: מהירות ערבוב: 750 סל"ד; טמפרטורה: 37 °C; רווח לחיישן: 2; מתח קיטוב: 800 mV; ומרווח רישום נתונים: 2.0 שניות.
   4. כדי לטעון את הכיול, לחץ פעמיים על התיבה Pos Calib בפינה התחתונה. פתח את הכיול שבוצע בשלב 2.2 (לחץ על Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) ולחץ על Calibrate and Copy to Clipboard.
      הערה: תיבת הקופה Calib תשתנה מצהוב לירוק. הנתונים מוצגים בתרשימי זרימת חמצן מתוקנת לפי נפח (פריסה 05 שטף לכל נפח לא תוקנה). פריסות שונות זמינות ב - Oxygraph > Layout.
   5. הוסף 5 μL של 0.5 M אדנוזין דיפוספט (ADP), 10 μL של 2 M גלוטמט, ו 2.5 μL של 0.4 M malate (ריכוזים סופיים: 1.25 mM, 10 mM, ו 0.5 mM). מדוד את צריכת החמצן עד שהאות מתייצב.
      הערה: מזרקי מיקרו Precision Hamilton משמשים להזרקה דרך יציאת הטעינה בפקק. השתמש מזרק אחד לכל תרופה כדי למנוע זיהום צולב. לחץ על F4 כדי להירשם, וסמן באוגר החמצן כאשר מתווסף טיפול.
      הערה: המצעים מוכנים במים טהורים במיוחד ומאוחסנים ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
   6. Tritate על ידי הוספת 1 μL של 10 mM digitonin בשלבים עוקבים עד צריכת החמצן מגיע לרמה מקסימלית.
      הערה: שטיפה יסודית במים, 70% אתנול ו-100% אתנול חיונית אם אותו תא משמש לשני ניסויים באותו יום.
      הערה: דיגיטונין מוכן במים טהורים במיוחד ומאוחסן ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
4. פרוטוקול הערכה נשימתי שגרתי לתאי זרע שלמים וחדירים, (קומפלקס I או קומפלקס II)
   1. פתחו את החדר, ושאפו את המדיום שבתוכו.
   2. עומס בתא לפחות 24 x 10⁶ ולא יותר מ 70 x 10⁶ תאי זרע בנפח סופי של 2 מ"ל של BWW (ניתוח תאים שלמים) או MRM (ניתוח תאים חדירים).
   3. התחל את הניסוי עם אותן הגדרות כמו עבור הכיול (זה מתואר בשלב 2.3.3).
   4. טען את הכיול שבוצע בשלב 2.2 כמתואר בשלב 2.3.4.
   5. רשום את הנשימה של התאים לפחות 5 דקות עד לקבלת אות יציב. מדידה זו מתאימה לנשימה בסיסית בתאים שלמים.
   6. אם הניסוי הוא עם תאים שלמים, המשך לשלב 2.4.9. עבור תאים חדירים, להזריק 4.5 μL של 10 mM digitonin (ריכוז סופי: 22.5 μM). חדיר את התאים במשך 5 דקות.
   7. הוסף את המצע: 10 μL של 2 M גלוטמט ו- 2.5 μL של 0.4 M malate (ריכוזים סופיים: 10 mM ו- 0.5 mM, בהתאמה) עבור קומפלקס I או 20 μL של 1 M succinate (ריכוז סופי: 10 mM) עבור קומפלקס II. מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב. זהו מצב 4, כלומר קומפלקס בסיסי I או קומפלקס בסיסי II נתמך נשימה בהיעדר ADP.
      הערה: המצעים מוכנים במים טהורים במיוחד ומאוחסנים ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
   8. יש להזריק 5 μL של 0.5 M ADP (ריכוז סופי: 1.25 mM). מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב. תוספת של ADP מגדילה את האות המתאים לצריכת החמצן המרבית באמצעות קומפלקס I או קומפלקס II (מצב 3, בתאים חדירים).
   9. הוסף 1 μL של 4 מ"ג / מ"ל אוליגומיצין (ריכוז סופי: 2 מיקרוגרם / מ"ל), מעכב סינטטאז ATP. מדדו את צריכת החמצן עד שהאות פוחת ומתייצב.
      הערה: אוליגומיצין מוכן אתנול ומאוחסן ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
   10. טיטראט על ידי הוספת 1 μL של 0.1 mM ל 1 mM קרבוניל ציאניד-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone (FCCP) בשלבים עוקבים עד לקצב נשימה בלתי מצומד מרבי. מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב.
       הערה: FCCP מוכן אתנול ומאוחסן ב -20 ° C במשך 3 חודשים.
   11. הריכוז הסופי של FCCP הוא תלוי דגימה. להפסיק להזריק את התרופה כאשר צריכת החמצן מתחילה לרדת.
   12. לבסוף, להזריק 1 μL של 5 mM antimycin A (ריכוז סופי 2.5 μM). זהו מעכב III מורכב כדי להבחין בין צריכת החמצן המיטוכונדריאלית לבין צריכת החמצן השיורית (נשימה שאינה מיטוכונדריאלית). לניתוח של קומפלקס I, להוסיף 1 μL של 1 mM rotenone (ריכוז סופי 0.5 μM), מעכב של קומפלקס זה, במקום AA. מדדו את צריכת החמצן עד שהאות פוחת ומתייצב.
       הערה: התרופות מוכנות באתנול ומאוחסנות ב -20 ° C במשך 3 חודשים.

3. חילוץ וניתוח נתונים

איור 2: רכישת פרמטרים נשימתיים מניסוי רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. (A,B) ייצוגים סכמטיים של גרפים שהתקבלו, כמתואר באיור 1, עבור תאים שלמים וחדירים, בהתאמה. פרמטרים אלה תוארו בעבר¹⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. גרור את העכבר על-ידי לחיצה על לחצן העכבר השמאלי ועל מקש Shift כדי לבחור אזורים שבהם שטף החמצן לכל נפח מתואם (Y2 O2 שיפוע uncorr., קו אדום) יציב לאחר הזרקת מצע או מעכב. איור 2 מציג את הפרמטרים השונים שהתקבלו מהאוגר שתואר קודם לכן¹⁵.
   הערה: הפרמטרים תלויים בניסוי; כולם כדלקמן: נשימה בסיסית בתאים שלמים ונשימה בנוכחות גלוטמט/מלאט או סוקצינאט (מצב 4), ADP (מצב 3), אוליגומיצין (דליפת פרוטון), FCCP (קצב נשימה מרבי), רוטנון/AA (נשימה לא מיטוכונדריאלית). בתאים חדירים, נשימה בסיסית מתאימה למצב 3.
2. לחץ על החלונות Marks > Statistics וייצא את הנתונים.
3. לנרמל את הנתונים המתקבלים לכל מיליון תאי זרע. יחידות המדרונות הן pmolO₂·s−1·mL−¹·10⁻⁶ תאים.
4. הפחיתו את צריכת החמצן הלא מיטוכונדריאלית מכל הערכים לפני חישוב המדדים.
5. חישוב המדדים באמצעות המשוואות השונות שתוארו לעיל¹⁵:
   

תוצאות

קביעת ריכוז אופטימלי של דיגיטונין בתאי זרע
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את השימוש ב-HRR כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב-OXPHOS בתאי זרע אנושיים. מאחר שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח זרע שלם או חדור דיגיטונין, אנו מציגים תחילה את הסטנדרטיזציה של ריכוז הדיגיטונין הנדרש כדי לחלחל תאי זרע (

Discussion

HRR תלוי באופן קריטי במספר שלבים: (א) תחזוקת הציוד, (ב) כיול מדויק של חיישני החמצן, (ג) טיטרציית uncoupler²⁶, ולבסוף, (ד) שימוש נאות במדדים המייצגים את תפקוד המיטוכונדריה. תחזוקת הציוד היא קריטית. מומלץ להחליף את קרומי חיישן החמצן הפולרוגרפי באופן קבוע ולתקן את הרקע האינסטרומנטלי. שטיפה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700