İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Özet

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

Özet

Semen kalitesi genellikle tanımlayıcı ve genellikle sonuçsuz olan rutin semen analizi ile incelenir. Erkek kısırlığı, değişmiş sperm mitokondriyal aktivitesi ile ilişkilidir, bu nedenle sperm mitokondriyal fonksiyonunun ölçümü, sperm kalitesinin bir göstergesidir. Yüksek çözünürlüklü respirometri, kapalı odacıklı bir sistemdeki hücrelerin veya dokuların oksijen tüketimini ölçme yöntemidir. Bu teknik, insan spermindeki solunumu ölçmek için uygulanabilir ve sperm mitokondrisinin kalitesi ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlar. Yüksek çözünürlüklü respirometri, hücrelerin serbestçe hareket etmesine izin verir, bu da sperm durumunda a priori bir avantajdır. Bu teknik, sağlam veya geçirgen spermatozoa ile uygulanabilir ve bozulmamış sperm mitokondriyal fonksiyonunun ve bireysel solunum zinciri komplekslerinin aktivitesinin incelenmesine izin verir. Yüksek çözünürlüklü oksigraf cihazı, oksijen tüketimini hesaplamak için hassas yazılımla birlikte oksijen konsantrasyonunu ölçmek için sensörler kullanır. Veriler, oksijen tüketim oranlarına göre solunum endekslerini hesaplamak için kullanılır. Sonuç olarak, endeksler iki oksijen tüketim oranının oranlarıdır ve hücre sayısına veya protein kütlesine dahili olarak normalleştirilir. Solunum indeksleri, sperm mitokondriyal fonksiyonunun ve işlev bozukluğunun bir göstergesidir.

Giriş

Erkek kısırlığının, çiftlerde tüm kısırlık vakalarının %40-50'sini oluşturduğu tahmin edilmektedir¹. Konvansiyonel semen analizi, erkek doğurganlığının belirlenmesinde çok önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, infertil erkeklerin yaklaşık% 15'i normal sperm parametrelerine sahiptir². Ek olarak, rutin semen analizi, sperm fonksiyonu hakkında sınırlı bilgi sağlar ve ince sperm kusurlarını yansıtmaz³.

Sperm mitokondrileri, kamçının etrafında sarmal bir kılıf olarak düzenlendikleri için özel bir yapıya sahiptir. Mitokondriyal kılıf, intermitokondriyal bağlayıcılarla bağlanan ve dış mitokondriyal zar ^4,5 üzerinde sıralı protein düzenlemeleri ile hücre iskeletine tutturulmuş değişken sayıda mitokondri içerir. Bu yapı, sperm mitokondrisini izole etmeyi özellikle zorlaştırır. Bu nedenle, sperm mitokondriyal fonksiyonu ile ilgili çoğu çalışmada in situ analizler veya demembranated sperm⁶ kullanılır.

Sperm mitokondriyal yapısı ve işlevi sürekli olarak erkek kısırlığı ile ilişkilendirilmiştir 7,8,9,10,11^, bu organellerin yapı ve işlevinin analizinin sperm analizine dahil edilmek için iyi bir aday olabileceğini düşündürmektedir.

Mitokondri, özellikle oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üretmek için oksijen kullanarak hücresel enerji metabolizmasında önemli bir rol oynar. Özellikle spermatozoada, ATP'nin kaynağı (glikoliz ve OXPHOS) tartışmalıdır ve verilerin çoğu tartışmalıdır ve farklı deneysel yaklaşımlara bağlıdır ^4,12,13. Oksimetre ile solunum ölçümleri, hücrenin mitokondriyal solunum kapasitesi, mitokondriyal bütünlüğü ve enerji metabolizması hakkında önemli bilgiler sunar^14,15,16. Geleneksel olarak, bu teknik, 50 yıldan fazla bir süredir mitokondriyal solunumu ölçmek için kullanılan bir alet olan Clark oksijen elektrodu kullanılarak gerçekleştirilmiştir^17,18. Ek olarak, sperm mitokondriyal oksijen tüketimi, klasik Clark oksijen elektrodu ^19,20,21 kullanılarak analiz edilmiştir. Oksigraf (Oroboros) kullanan yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR), klasik respirometri cihazlarının kullanımına göre daha yüksek hassasiyet sağlar²². Oksigraflar, enjeksiyon portlarına sahip iki odadan oluşur ve her odada bir polarografik oksijen sensörü bulunur. Bu teknikle doku slaytlarını, hücreleri ve izole mitokondriyal süspansiyonları analiz etmek mümkündür. Numune haznede sürekli olarak karıştırılır ve deney sırasında oksijen tüketimi ölçülür ve oksijen oranları özel bir yazılım kullanılarak hesaplanır. Odalar, geleneksel oksijen elektrot cihazlarına göre bir avantaj olan oksijen sızıntısının azaldığını gösterir^14,23.

Diğer hücrelerde olduğu gibi, spermatozoa durumunda, HRR ekipmanının duyarlılığı geleneksel respirometriden daha yüksektir, yani HRR ekipmanının sınırlı sayıda bozulmamış veya geçirgen sperm hücresinin analizi için kullanılabileceği anlamına gelir. HRR ile sperm mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için iki ana strateji vardır: (a) glikoz gibi substratlar içeren bir ortamda solunum fonksiyonunun yeniden üretilmesini içeren bozulmamış hücrelerde oksijen tüketiminin ölçülmesi veya (b) her bir fonksiyonu ayrı ayrı izlemek için spesifik substratların eklenmesiyle OXPHOS komplekslerinden birini kullanarak geçirgen hücrelerde oksijen tüketimini ölçmek.

Bu çalışmada, insan sperm hücrelerinde mitokondriyal solunumu belirlemek için HRR'nin kullanımını tanımladık.

Protokol

Deneyler, Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay Etik Komitesi tarafından onaylandı.

Şekil 1: Bozulmamış ve geçirgen insan sperminde mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü respirometri için iş akışı. Protokol dört farklı adıma bölünmüştür: 1) numunenin hazırlanması, 2) Oroboros cihazında oksijen kalibrasyonu, 3) bozulmamış ve geçirgen hücreler için oksijen tüketimi ölçümü ve 4) ekipmandan veri çıkarma ve analiz. Kısaltmalar: CASA = bilgisayar destekli sperm analizi; BWW = Biggers Whitten Whittingham orta; MRM = mitokondriyal solunum ortamı; ADP = adenozin difosfat; FCCP = karbonil siyanür -p- triflorometoksifenilhidrazon; AA = antimisin A. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: HRR kullanarak sperm hücrelerinde oksijen tüketimini ölçmek için iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir. Protokolde kullanılan malzemeler, ekipman ve reaktifler hakkındaki bilgiler Malzeme Tablosunda sunulmaktadır.

1. Numune hazırlama

1. Numune koleksiyonu
   1. Steril bir plastik kapta önerilen 3 günlük yoksunluktan sonra mastürbasyon yoluyla yeni boşalmış insan spermi toplayın. Numuneleri hemen laboratuvara taşıyın.
   2. Numuneleri tamamen sıvılaştırmak için oda sıcaklığında (RT) 30-60 dakika inkübe edin²⁴.
   3. Sıvılaştırmadan sonra, deney başlayana kadar numuneleri 37 °C'de saklayın.
2. Bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) ile sperm değerlendirmesi
   1. Numuneyi karıştırın ve önceden ısıtılmış bir sperm sayma odasına 7 μL yükleyin.
   2. Odayı doğrudan ışık mikroskobunun önceden ısıtılmış (37 °C) aşamasına yerleştirin.
   3. Bilgisayarlı sperm analiz yazılımını açın ve motilite ve konsantrasyon modülüne girin ( Mot'a tıklayın).
   4. İnsan sperm koşullarına karşılık gelen konfigürasyonu seçin.
      NOT: Konfigürasyon, haznenin tipine ve derinliğine, ayrıca numune türlerine ve CASA sistemine uyarlanmalıdır.
   5. Analiz düğmesine tıklayarak oda başına 10 farklı alanı rastgele analiz edin.
   6. Numune konsantrasyonunu ve hareketliliğini elde etmek için Sonuçlar'a tıklayın.
3. Hücre hazırlığı
   NOT: HRR kalibre edilmemişse, hücreleri hazırlamadan önce 2.1-2.2 adımlarıyla başlayın (adım 1.3). Sperm hücreleri besiyerinde yeniden süspanse edildiğinde oksijen tüketiminin hemen ölçülmesi önemlidir.
   1. Numuneleri RT'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
   2. Seminal plazmayı çıkarın ve bozulmamış hücrelerle yapılan deneyler için 2 mL Biggers Whitten Whittingham (BWW) veya geçirgen hücrelerle yapılan çalışmalar için mitokondriyal solunum ortamı (MRM) içinde spermatozoayı yeniden süspanse edin. Ortamın kompozisyonları Tablo 1'de gösterilmektedir.
   3. Sperm konsantrasyonu çalışmaları için adım 1.2'de açıklanan adımları tekrarlayın.

2. Yüksek çözünürlüklü respirometri: OXPHOS analizi

NOT: HRR, son derece hassas oksigrafları (Oksigraf-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Avusturya) yazılımlı (DatLab, sürüm 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Deneysel veriler, zamana karşı oksijen konsantrasyonu (O₂/10⁶ hücrenin pmol'ü · min⁻¹ olarak) ve bu verilerin gerçek zamanlı dönüşümleri olarak görüntülenir ve deneycinin solunumunu izlemesine olanak tanır (oksijen tüketimi, oksijen akışı) deney devam ederken biyolojik ve biyokimyasal örnekler. HRR, hareketliliği sperm kalitesi ve doğurganlık potansiyeli ile ilişkili olan sperm için özellikle yararlı olan canlı ve hareketli hücrelerin solunumunu takip etmek için kullanılabilir. Laboratuvar, iki odacıklı bir HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments kullanmaktadır. Bu protokolde açıklanan adımlar, her iki 2 mL oda için bağımsız olarak gerçekleştirilmelidir.

1. Ekipman hazırlığı
   1. HRR'yi açın ve veri toplama ve analiz için respirometri yazılımına (DatLab) bağlayın.
   2. Oksigraf odasındaki %70 etanolü_ddH2Oile değiştirin. Haznedeki manyetik karıştırma çubuğu ile 750 rpm'de sürekli karıştırın. 10 dakika bekletin ve daha sonra çift damıtılmış (dd)_H2O'yuaspire edin.
   3. Hazneyi her seferinde 5 dakika boyunca ddH₂O ile üç kez yıkayın.
      NOT: Bu adım, kalan etanolü odalardan çıkarmak için gereklidir. Sperm hücreleri etanole karşı çok hassastır. Bu adım atlanırsa kayıt tehlikeye girebilir.
2. Oksijen sensörlerinin kalibrasyonu
   NOT: Kalibrasyon prosedürü, cihaza bağlı olarak biraz değişir. Polarografik oksijen sensörünün hava kalibrasyonunu üretici tarafından açıklandığı gibi^{gerçekleştirin 25}. Bu bölümde kalibrasyon protokolü kısaca anlatılmıştır.
   1. ddH 2 O'yu çıkarın ve hücre hazırlığı için kullanılan aynı ortamdan₂mL'yi hazneye pipetleyin. Tıpaları bir hava değişim balonu bırakarak yerleştirin.
      NOT: İhtiyaç duyulan ortamın tam hacmini belirlemek için haznenin hacmini bilmek önemlidir.
   2. Ortamı karıştırma çubuğu ile 750 rpm'de 30 °C'de en az 37 dakika karıştırarak sensör membranının performansını izlemek için oksijen kalibrasyon değerlerini kaydedin ( Düzen > 01 Kalibrasyon Exp. Gr3-Temp'e tıklayın). Belirtilen diğer ayarları kullanın: sensör için kazanç: 2; polarizasyon voltajı: 800 mV; veri kayıt aralığı: 2,0 sn.
      NOT: Polarografik sensörden kararlı bir sinyal ile ±2 pmol∙s−1∙mL⁻¹ içinde düzeltilmemiş bir O 2 eğimi (kırmızı çizgi) elde edilmesi beklenir.
   3. Oksijen konsantrasyonundaki değişimin (Y1 O2 Konsantrasyonu, mavi çizgi) sabit olduğu bir alan seçmek için farenin sol düğmesini ve shift tuşunu basılı tutarken fareyi sürükleyin.
   4. O₂ Kalibrasyonu penceresini açın (O2 Kalibrasyonu > Oksigraf'a tıklayın). Hava Kalibrasyonu'nda, seçilen işareti adım 2.2.3'te seçilen bölgeyle değiştirin. Kalibre Et ve Panoya Kopyala'ya tıklayarak bitirin.
   5. Kaydı durdurun ve Oxygraph > Tamam Kontrolü > Kaydet ve Bağlantıyı Kes'e tıklayarak kaydedin.
      NOT: Bu veri kümesi, günün tüm deneylerinde kullanılabilmesi için kaydedilmelidir. Kalibrasyon, her ortam için günde yalnızca bir kez gerçekleştirilir.
3. Digitonin geçirgenlik titrasyonu
   1. Hazneyi açın ve içindeki ortamı aspire edin.
   2. Hazneye en az 24 x 10 6 ve en fazla 70 x 10⁶ sperm hücresi 2 mL MRM'nin son hacmine yükleyin.
      NOT: Deney sonunda oksijen tüketimini ayarlamak için haznedeki hücre sayısını ölçmek önemlidir. Önerilenden daha az sayıda hücre ölçülemez.
   3. Tıpaları sonuna kadar iterek hazneyi kapatın ve üstte kalan sıvıyı aspire edin. Deneyi kalibrasyonla aynı ayarlarla başlatın: karıştırma hızı: 750 rpm; sıcaklık: 37 °C; sensör için kazanç: 2; polarizasyon voltajı: 800 mV; ve veri kayıt aralığı: 2,0 sn.
   4. Kalibrasyonu yüklemek için alt köşedeki Pos Calib kutusuna çift tıklayın. Adım 2.2'de gerçekleştirilen kalibrasyonu açın ( Oksigraf > O2 Kalibrasyonu > Dosyadan Kopyala'ya tıklayın) ve Kalibre Et ve Panoya Kopyala'ya tıklayın.
      NOT: POS Calib kutusu sarıdan yeşile dönecektir. Veriler, hacim başına düzeltilmiş oksijen akışı grafiklerinde görüntülenir (Düzen 05 Hacim Başına Akı düzeltilmemiş). Oxygraph > Layout'ta farklı düzenler mevcuttur.
   5. 5 μL 0.5 M adenosin difosfat (ADP), 10 μL 2 M glutamat ve 2.5 μL 0.4 M malat ekleyin (son konsantrasyonlar: 1.25 mM, 10 mM ve 0.5 mM). Sinyal stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün.
      NOT: Hassas Hamilton mikro şırıngaları, durdurucudaki yükleme portundan enjeksiyon için kullanılır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için ilaç başına bir şırınga kullanın. Kaydolmak için F4'e tıklayın ve bir tedavi eklendiğinde oksijen kaydında işaretleyin.
      NOT: Substratlar ultra saf suda hazırlanır ve −20 °C'de 3 ay saklanır.
   6. Oksijen tüketimi maksimum seviyeye ulaşana kadar ardışık adımlarla 1 μL 10 mM digitonin ekleyerek tritatlayın.
      NOT: Aynı hazne aynı gün içinde iki deney için kullanılıyorsa, su, %70 etanol ve %100 etanol ile iyice yıkama esastır.
      NOT: Digitonin ultra saf suda hazırlanır ve −20 °C'de 3 ay saklanır.
4. Sağlam ve geçirgen sperm hücreleri için rutin solunum değerlendirme protokolü (kompleks I veya kompleks II)
   1. Hazneyi açın ve içindeki ortamı aspire edin.
   2. Hazneye en az 24 x 10 6 ve en fazla 70 x 10⁶ sperm hücresi 2 mL BWW (bozulmamış hücre analizi) veya MRM (geçirgen hücre analizi) nihai hacminde yükleyin.
   3. Deneyi, kalibrasyonla aynı ayarlarla başlatın (bu, adım 2.3.3'te açıklanmıştır).
   4. Adım 2.2'de gerçekleştirilen kalibrasyonu adım 2.3.4'te açıklandığı gibi yükleyin.
   5. Kararlı bir sinyal elde edilene kadar hücrelerin solunumunu en az 5 dakika kaydedin. Bu ölçüm, sağlam hücrelerde bazal solunuma karşılık gelir.
   6. Deney sağlam hücrelerle yapılıyorsa, adım 2.4.9'a geçin. Geçirgen hücreler için 4.5 μL 10 mM digitonin enjekte edin (son konsantrasyon: 22.5 μM). Hücreleri 5 dakika geçirgenleştirin.
   7. Substratları ekleyin: kompleks I için 10 μL 2 M glutamat ve 2.5 μL 0.4 M malat (nihai konsantrasyonlar: sırasıyla 10 mM ve 0.5 mM) veya kompleks II için 20 μL 1 M süksinat (son konsantrasyon: 10 mM). Sinyal artana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün. Bu, ADP yokluğunda bazal kompleks I veya bazal kompleks II destekli solunum anlamına gelen durum 4'tür.
      NOT: Substratlar ultra saf suda hazırlanır ve −20 °C'de 3 ay saklanır.
   8. 5 μL 0.5 M ADP enjekte edin (son konsantrasyon: 1.25 mM). Sinyal artana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün. ADP'nin eklenmesi, kompleks I veya kompleks II (geçirgen hücrelerde durum 3) yoluyla maksimum oksijen tüketimine karşılık gelen sinyali arttırır.
   9. Bir ATP sentetaz inhibitörü olan 1 μL 4 mg / mL oligomisin (son konsantrasyon: 2 μg / mL) ekleyin. Sinyal azalana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün.
      NOT: Oligomisin etanol içinde hazırlanır ve −20 °C'de 3 ay saklanır.
   10. Maksimum bağlanmamış solunum hızına ulaşılana kadar art arda adımlarla 1 μL 0,1 mM karbonil siyanür-P-triflorometoksi-fenilhidrazon (FCCP) ekleyerek titre edin. Sinyal artana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün.
       NOT: FCCP etanol içinde hazırlanır ve −20 °C'de 3 ay saklanır.
   11. FCCP'nin nihai konsantrasyonu numuneye bağlıdır. Oksijen tüketimi azalmaya başladığında ilacı enjekte etmeyi bırakın.
   12. Son olarak, 1 μL 5 mM antimisin A (2.5 μM nihai konsantrasyon) enjekte edin. Bu, mitokondriyal ve artık oksijen tüketimi (mitokondriyal olmayan solunum) arasında ayrım yapmak için karmaşık bir III inhibitörüdür. Kompleks I'in analizi için, AA yerine bu kompleksin bir inhibitörü olan 1 μL 1 mM rotenon (0.5 μM nihai konsantrasyon) ekleyin. Sinyal azalana ve stabilize olana kadar oksijen tüketimini ölçün.
       NOT: İlaçlar etanol içinde hazırlanır ve −20 °C'de 3 ay saklanır.

3. Veri çıkarma ve analiz

Şekil 2: Yüksek çözünürlüklü bir respirometri deneyinden solunum parametrelerinin elde edilmesi. (A,B) Şekil 1'de açıklandığı gibi, sırasıyla bozulmamış ve geçirgen hücreler için elde edilen grafiklerin şematik gösterimleri. Bu parametreler daha önce¹⁵ olarak tanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Bir substrat veya inhibitörün enjeksiyonundan sonra hacim başına oksijen akışının ilişkili olduğu bölgeleri (Y2 O2 eğimi, kırmızı çizgi) seçmek için farenin sol düğmesine ve shift tuşuna basarak fareyi sürükleyin. Şekil 2 , daha önce açıklanan kayıttan elde edilen farklı parametreleri göstermektedir¹⁵.
   NOT: Parametreler deneye bağlıdır; hepsi şu şekildedir: sağlam hücrelerde bazal solunum ve glutamat/malat veya süksinat varlığında solunum (durum 4), ADP (durum 3), oligomisin (proton kaçağı), FCCP (maksimum solunum hızı), rotenon/AA (mitokondriyal olmayan solunum). Geçirgen hücrelerde, bazal solunum durum 3'e karşılık gelir.
2. İstatistikler > İşaretler pencerelerine tıklayın ve verileri dışa aktarın.
3. 1 milyon sperm hücresi başına elde edilen verileri normalleştirin. Eğimlerin birimleri pmolO₂·s−1·mL−¹·10⁻⁶ hücredir.
4. İndeksleri hesaplamadan önce mitokondriyal olmayan oksijen tüketimini tüm değerlerden çıkarın.
5. Daha önce açıklanan çeşitli denklemleri kullanarak endeksleri hesaplayın¹⁵:
   

Sonuçlar

Sperm hücrelerinde optimal digitonin konsantrasyonunun belirlenmesi
Bu protokolde, insan sperm hücrelerinde OXPHOS'taki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için HRR kullanımını sunuyoruz. Yöntem, bozulmamış veya digitonin geçirgenmiş spermleri analiz etmek için kullanılabildiğinden, öncelikle sperm hücrelerini geçirgenleştirmek için gerekli olan digitonin konsantrasyonunun standardizasyonunu sunuyoruz (Şekil 3).

Digito...

Tartışmalar

HRR kritik olarak birkaç adıma bağlıdır: (a) ekipman bakımı, (b) oksijen sensörlerinin doğru kalibrasyonu, (c) bağlayıcı çözücü titrasyonu²⁶ ve son olarak (d) mitokondriyal fonksiyonu temsil eden indekslerin yeterli kullanımı. Ekipman bakımı çok önemlidir. Polarografik oksijen sensörünün membranlarının düzenli olarak değiştirilmesi ve enstrümantal arka planın düzeltilmesi önerilir. Spermatozoanın odalardan toplanmasından sonra, özellikle aletlerin çeşitli dok...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700