İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Özet

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

Özet

Semen kalitesi genellikle tanımlayıcı ve genellikle sonuçsuz olan rutin semen analizi ile incelenir. Erkek kısırlığı, değişmiş sperm mitokondriyal aktivitesi ile ilişkilidir, bu nedenle sperm mitokondriyal fonksiyonunun ölçümü, sperm kalitesinin bir göstergesidir. Yüksek çözünürlüklü respirometri, kapalı odacıklı bir sistemdeki hücrelerin veya dokuların oksijen tüketimini ölçme yöntemidir. Bu teknik, insan spermindeki solunumu ölçmek için uygulanabilir ve sperm mitokondrisinin kalitesi ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlar. Yüksek çözünürlüklü respirometri, hücrelerin serbestçe hareket etmesine izin verir, bu da sperm durumunda a priori bir avantajdır. Bu teknik, sağlam veya geçirgen spermatozoa ile uygulanabilir ve bozulmamış sperm mitokondriyal fonksiyonunun ve bireysel solunum zinciri komplekslerinin aktivitesinin incelenmesine izin verir. Yüksek çözünürlüklü oksigraf cihazı, oksijen tüketimini hesaplamak için hassas yazılımla birlikte oksijen konsantrasyonunu ölçmek için sensörler kullanır. Veriler, oksijen tüketim oranlarına göre solunum endekslerini hesaplamak için kullanılır. Sonuç olarak, endeksler iki oksijen tüketim oranının oranlarıdır ve hücre sayısına veya protein kütlesine dahili olarak normalleştirilir. Solunum indeksleri, sperm mitokondriyal fonksiyonunun ve işlev bozukluğunun bir göstergesidir.

Giriş

Erkek kısırlığının, çiftlerde tüm kısırlık vakalarının %40-50'sini oluşturduğu tahmin edilmektedir¹. Konvansiyonel semen analizi, erkek doğurganlığının belirlenmesinde çok önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, infertil erkeklerin yaklaşık% 15'i normal sperm parametrelerine sahiptir². Ek olarak, rutin semen analizi, sperm fonksiyonu hakkında sınırlı bilgi sağlar ve ince sperm kusurlarını yansıtmaz³.

Sperm mitokondrileri, kamçının etrafında sarmal bir kılıf olarak düzenlendikleri için özel bir yapıya sahiptir. Mitokondriyal kılıf, intermitokondriyal bağlayıcılarla bağla....

Protokol

Deneyler, Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay Etik Komitesi tarafından onaylandı.

Şekil 1: Bozulmamış ve geçirgen insan sperminde mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü respirometri için iş akışı. Protokol dört farklı adıma bölünmüştür: 1) numunenin hazırlanması, 2) Oroboros cihazında oksijen kalibrasyonu, 3) bozulmamış ve geçirgen hücreler için oksijen tüketimi ölç....

Tartışmalar

HRR kritik olarak birkaç adıma bağlıdır: (a) ekipman bakımı, (b) oksijen sensörlerinin doğru kalibrasyonu, (c) bağlayıcı çözücü titrasyonu²⁶ ve son olarak (d) mitokondriyal fonksiyonu temsil eden indekslerin yeterli kullanımı. Ekipman bakımı çok önemlidir. Polarografik oksijen sensörünün membranlarının düzenli olarak değiştirilmesi ve enstrümantal arka planın düzeltilmesi önerilir. Spermatozoanın odalardan toplanmasından sonra, özellikle aletlerin çeşitli dok.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700