인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

요약

고분해능 호흡 측정법에 의한 정자 미토콘드리아 기능 분석은 밀폐 챔버 시스템에서 자유롭게 움직이는 정자의 산소 소비량을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 정자 미토콘드리아 특성 및 무결성에 대한 정보를 제공하는 인간 정자의 호흡을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.

초록

정액의 질은 종종 일상적인 정액 분석을 통해 연구되며, 이는 설명적이며 종종 결정적이지 않습니다. 남성 불임은 정자 미토콘드리아 활동의 변화와 관련이 있으므로 정자 미토콘드리아 기능의 측정은 정자의 질을 나타내는 지표입니다. 고분해능 호흡 측정법은 밀폐 챔버 시스템에서 세포 또는 조직의 산소 소비량을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 인간 정자의 호흡을 측정하기 위해 구현될 수 있으며 정자 미토콘드리아의 품질과 무결성에 대한 정보를 제공합니다. 고해상도 호흡 측정법은 세포가 자유롭게 움직일 수 있도록 하며, 이는 정자의 경우 선험적 이점입니다. 이 기술은 온전하거나 투과된 정자와 함께 적용할 수 있으며 온전한 정자 미토콘드리아 기능과 개별 호흡 사슬 복합체의 활성을 연구할 수 있습니다. 고분해능 산소 그래프 기기는 센서를 사용하여 산소 농도를 측정하고 민감한 소프트웨어와 함께 산소 소비량을 계산합니다. 이 데이터는 산소 소비 비율을 기반으로 호흡 지수를 계산하는 데 사용됩니다. 결과적으로, 지수는 두 산소 소비율의 비율이며 내부적으로 세포 수 또는 단백질 질량으로 정규화됩니다. 호흡 지수는 정자 미토콘드리아 기능과 기능 장애를 나타내는 지표입니다.

서문

남성 불임은 부부 불임 사례의 40%-50%를 차지하는 것으로 추정된다¹. 기존의 정액 분석은 남성의 생식력을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 불임 남성의 약 15%는 정상적인 정자 매개변수를 가지고 있다². 또한, 일상적인 정액 분석은 정자 기능에 대한 제한된 정보를 제공하며 미묘한 정자 결함을 반영하지 않는다³.

정자 미토콘드리아는 편모 주위에 나선형 덮개로 배열되어 있기 때문에 특별한 구조를 가지고 있습니다. 미토콘드리아 외피는 미토콘드리아 간 링커에 의해 연결되고 외부 미토콘드리아 막 ^4,5 상의 정렬된 단백질 배열에 의해 세포골격에 고정되는 다양한 수의 미토콘드리아를 포함합니다. 이 구조는 정자 미토콘드리아를 분리하는 것을 특히 어렵게 만듭니다. 따라서 정자 미토콘드리아 기능에 대한 대부분의 연구는 현장 분석 또는 demembranated sperm⁶을 사용한다.

정자 미토콘드리아 구조....

프로토콜

실험은 우루과이 몬테비데오에 있는 Facultad de Medicina de la Universidad de la República의 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

그림 1: 온전하고 투과된 인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법의 워크플로우. 프로토콜은 1) 샘플 준비, 2) Oroboros 기기에서의 산소 보정, 3) 온전한 세포와 투과된 세포에 대한 산소 소비량 측정, 4) 장비에서 데이터 추출 및 분석의 네 가지 단계로 나뉩니다. 약어: CASA = 컴퓨터 보조 정자 분석; BWW = Biggers Whitten Whittingham 미디엄; MRM = 미토콘드리아 호흡 배지; ADP = 아데노신 이인산; FCCP = 카르보닐 시안화물 -p-트리플루오로메톡시페닐히드라존; AA = antimycin A.

토론

HRR은 (a) 장비 유지보수, (b) 산소 센서의 정확한 교정, (c) 언커플러 적정(²⁶), 그리고 마지막으로 (d) 미토콘드리아 기능을 나타내는 지수의 적절한 사용과 같은 몇 가지 단계에 따라 결정적으로 달라집니다. 장비 유지 보수는 매우 중요합니다. 폴라로그래픽 산소 센서의 멤브레인을 정기적으로 교체하고 기기 배경을 수정하는 것이 좋습니다. 챔버에서 정자를 채취 한 후 광범위한 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700