Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

Resumo

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Resumo

A qualidade do sêmen é frequentemente estudada pela análise seminal de rotina, que é descritiva e muitas vezes inconclusiva. A infertilidade masculina está associada à atividade mitocondrial alterada dos espermatozoides, de modo que a medição da função mitocondrial dos espermatozoides é um indicador da qualidade dos espermatozoides. A respirometria de alta resolução é um método de medir o consumo de oxigênio de células ou tecidos em um sistema de câmara fechada. Esta técnica pode ser implementada para medir a respiração em espermatozoides humanos e fornece informações sobre a qualidade e integridade das mitocôndrias espermáticas. A respirometria de alta resolução permite que as células se movam livremente, o que é uma vantagem a priori no caso dos espermatozoides. Esta técnica pode ser aplicada com espermatozoides intactos ou permeabilizados e permite o estudo da função mitocondrial intacta dos espermatozoides e da atividade de complexos de cadeias respiratórias individuais. O instrumento de oxigrafia de alta resolução usa sensores para medir a concentração de oxigênio juntamente com um software sensível para calcular o consumo de oxigênio. Os dados são usados para calcular índices respiratórios com base nas razões de consumo de oxigênio. Consequentemente, os índices são as proporções de duas taxas de consumo de oxigênio e são normalizados internamente para o número celular ou massa proteica. Os índices respiratórios são um indicador da função e disfunção mitocondrial dos espermatozoides.

Introdução

Estima-se que a infertilidade masculina seja responsável por 40%-50% de todos os casos de infertilidade em casais¹. A análise seminal convencional desempenha um papel crucial na determinação da fertilidade masculina; no entanto, aproximadamente 15% dos homens inférteis apresentam parâmetros espermáticos normais². Além disso, a análise seminal de rotina fornece informações limitadas sobre a função espermática e não reflete defeitos sutis espermáticos³.

As mitocôndrias espermáticas têm uma estrutura especial, pois estão dispostas como uma bainha helicoidal ao redor dos flagelos. A bainha mitocondrial contém um número variável de mitocôndrias conectadas por ligantes intermitocondriais e ancoradas ao citoesqueleto por arranjos proteicos ordenados na membrana mitocondrial externa ^4,5. Esta estrutura torna particularmente difícil isolar as mitocôndrias dos espermatozoides. Portanto, a maioria dos estudos sobre a função mitocondrial dos espermatozoides utiliza análises in situ ou espermatozoides desembrandados⁶.

A estrutura e a função mitocondrial espermática têm sido consistentemente associadas à infertilidade masculina 7,8,9,10,11^, sugerindo que a análise da estrutura e função dessas organelas pode ser uma boa candidata para inclusão na análise espermática.

As mitocôndrias desempenham um papel importante no metabolismo energético celular, particularmente usando oxigênio para produzir trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa (OXPHOS). Nos espermatozoides, em particular, a fonte de ATP (glicólise vs. OXPHOS) é contestada, e muitos dos dados permanecem controversos e dependem de diferentes abordagens experimentais4,12,13. Medidas da respiração por oximetria oferecem informações significativas sobre a capacidade respiratória mitocondrial, integridade mitocondrial e metabolismo energético da célula^14,15,16. Tradicionalmente, essa técnica tem sido realizada com o eletrodo de oxigênio de Clark, instrumento utilizado para medir a respiração mitocondrial há mais de 50 anos^17,18. Além disso, o consumo de oxigênio mitocondrial dos espermatozoides foi analisado utilizando-se o clássico eletrodo de oxigênio de Clark 19,20,21. A respirometria de alta resolução (FCR) utilizando oxígrafos (Oroboros) fornece maior sensibilidade do que usando os aparelhos de respirometria clássica²². Os oxígrafos são compostos por duas câmaras com portas de injeção, e cada câmara possui um sensor polarográfico de oxigênio. Com essa técnica, é possível analisar lâminas teciduais, células e suspensões mitocondriais isoladas. O espécime é continuamente agitado na câmara e, durante o experimento, o consumo de oxigênio é medido e as taxas de oxigênio são calculadas usando um software específico. As câmaras apresentam menor extravasamento de oxigênio, o que é uma vantagem sobre os aparelhos convencionais de eletrodos de oxigênio^14,23.

Como acontece com outras células, no caso dos espermatozoides, a sensibilidade do equipamento HRR é maior do que para a respirometria convencional, o que significa que o equipamento HRR pode ser usado para a análise de um número limitado de espermatozoides intactos ou permeabilizados. Existem duas estratégias principais para avaliar a função mitocondrial espermática pela HRR: (a) medir o consumo de oxigênio em células intactas, que envolve a reprodução da função respiratória em um meio contendo substratos como glicose, ou (b) medir o consumo de oxigênio em células permeabilizadas usando um dos complexos de OXFOS, com a adição de substratos específicos para monitorar cada função separadamente.

No presente estudo, descrevemos o uso da HRR para determinar a respiração mitocondrial em espermatozoides humanos.

Protocolo

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade da República, Montevidéu, Uruguai.

Figura 1: Fluxo de trabalho para respirometria de alta resolução para avaliar a função mitocondrial em espermatozoides humanos intactos e permeabilizados. O protocolo foi dividido em quatro etapas distintas: 1) preparação da amostra, 2) calibração do oxigênio no instrumento Oroboros, 3) medição do consumo de oxigênio para células intactas e permeabilizadas e 4) extração dos dados do equipamento e análise. Abreviações: CASA = análise espermática assistida por computador; BWW = Biggers Whitten Whittingham médio; MRM = meio de respiração mitocondrial; ADP = difosfato de adenosina; FCCP = cianeto de carbonila -p- trifluorometoxifenilhidrazona; AA = antimicina A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: O fluxo de trabalho para medir o consumo de oxigênio em células espermáticas usando HRR é mostrado na Figura 1. As informações sobre os materiais, equipamentos e reagentes utilizados no protocolo são apresentadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação da amostra

1. Coleta de amostras
   1. Coletar sêmen humano recém-ejaculado por masturbação após uma abstinência recomendada de 3 dias em um recipiente plástico estéril. Transportar as amostras imediatamente para o laboratório.
   2. Incubar as amostras por 30-60 min à temperatura ambiente (TR) para liquefazer completamente²⁴.
   3. Após liquefação, armazenar as amostras a 37 °C até ao início da experiência.
2. Avaliação espermática com análise espermática auxiliada por computador (CASA)
   1. Misture a amostra e carregue 7 μL em uma câmara de contagem de espermatozoides pré-aquecida.
   2. Coloque a câmara no estágio pré-aquecido (37 °C) de um microscópio de luz direta.
   3. Abra o software computadorizado de análise de espermatozoides e, entre no módulo de motilidade e concentração (clique em Mot).
   4. Selecione a configuração que corresponde às condições do esperma humano.
      NOTA: A configuração deve ser adaptada ao tipo e profundidade da câmara, bem como à espécie de amostra e ao sistema CASA.
   5. Analise aleatoriamente 10 campos diferentes por câmara clicando no botão Analisar .
   6. Clique em Resultados para obter a concentração e motilidade da amostra.
3. Preparação celular
   NOTA: Se a HRR não estiver calibrada, comece com os passos 2.1-2.2 antes de preparar as células (passo 1.3). É importante medir o consumo de oxigênio imediatamente quando os espermatozoides são ressuspensos no meio.
   1. Centrifugar as amostras a 400 x g durante 10 min em RT.
   2. Remover o plasma seminal e ressuspender os espermatozoides em 2 mL de Biggers Whitten Whittingham (BWW) para experimentos com células intactas ou meio respiratório mitocondrial (MRM) para estudos com células permeabilizadas. As composições das mídias são mostradas na Tabela 1.
   3. Repita os passos descritos no passo 1.2 para estudos de concentração de espermatozoides.

2. Respirometria de alta resolução: análise de OXPHOS

NOTA: HRR integra oxigrafias altamente sensíveis (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Áustria) com software (DatLab, versão 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Os dados experimentais são apresentados como a concentração de oxigênio versus o tempo (como pmol de O₂/10⁶ células·min⁻¹) e como transformações em tempo real desses dados, permitindo ao experimentador rastrear a respiração (consumo de oxigênio, fluxo de oxigênio) de amostras biológicas e bioquímicas enquanto o experimento ainda está em execução. A HRR pode ser usada para acompanhar a respiração de células vivas e móveis, o que é particularmente útil para espermatozoides, cuja motilidade está associada à qualidade espermática e potencial de fertilidade. O laboratório utiliza um HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, com duas câmaras. As etapas descritas neste protocolo devem ser realizadas independentemente para ambas as câmaras de 2 mL.

1. Preparação do equipamento
   1. Ligue o HRR e conecte-o ao software de respirometria (DatLab) para aquisição e análise de dados.
   2. Substitua o etanol a 70% na câmara oxigráfica por ddH₂O. Agite-o continuamente com a barra de agitação magnética na câmara a 750 rpm. Deixe descansar por 10 min, e aspirar o bidestilado (dd) H₂O depois.
   3. Lave a câmara três vezes com ddH₂O por 5 min cada vez.
      NOTA: Esta etapa é necessária para remover o etanol restante das câmaras. Os espermatozoides são muito sensíveis ao etanol. A gravação pode ser comprometida se essa etapa for omitida.
2. Calibração dos sensores de oxigênio
   NOTA: O procedimento de calibração varia ligeiramente dependendo do instrumento. Efectuar uma calibração do ar do sensor polarográfico de oxigénio conforme descrito pelo fabricante²⁵. Nesta seção, o protocolo de calibração é explicado brevemente.
   1. Retirar o ddH 2 O e pipetar₂mL do mesmo meio utilizado para o preparo celular para a câmara. Coloque as rolhas, deixando uma bolha de troca de ar.
      NOTA: É importante saber o volume da câmara para determinar o volume exato de meio necessário.
   2. Registre os valores de calibração de oxigênio (clique em Layout > 01 Calibração Exp. Gr3-Temp) para monitorar o desempenho da membrana do sensor agitando o meio com a barra de agitação a 750 rpm por pelo menos 30 min a 37 °C. Use as outras configurações como mencionado: ganho para sensor: 2; tensão de polarização: 800 mV; Intervalo de gravação de dados: 2,0 s.
      NOTA: Espera-se obter uma inclinação O 2 não corrigida (linha vermelha) dentro de ±₂ pmol∙s−1∙mL⁻¹ com um sinal estável do sensor polarográfico.
   3. Arraste o mouse enquanto mantém pressionado o botão esquerdo do mouse e a tecla shift para selecionar uma área onde a mudança na concentração de oxigênio (Concentração de O2 Y1, linha azul) é estável.
   4. Abra a janela Calibração do O₂ (clique em Oxigrafo > Calibração do O2). Em Calibração do ar, altere a marca selecionada para a região selecionada na etapa 2.2.3. Termine clicando em Calibrar e Copiar para a Área de Transferência.
   5. Pare a gravação e salve clicando em Oxygraph > Ok Control > Save and Disconnect.
      Observação : esse conjunto de dados deve ser salvo para que ele possa ser usado em todos os experimentos do dia. A calibração é realizada apenas uma vez ao dia para cada meio.
3. Titulação digitonina-permeabilização
   1. Abra a câmara e aspirar o meio para dentro.
   2. Carregar na câmara pelo menos 24 x 10 6 e não mais do que 70 x 10⁶ espermatozoides em um volume final de 2 mL de MRM.
      NOTA: É importante medir o número de células na câmara para ajustar o consumo de oxigênio ao final do experimento. Um número menor de células do que o recomendado não pode ser medido.
   3. Feche a câmara empurrando as rolhas até o fim e aspirar o líquido restante na parte superior. Inicie o experimento com as mesmas configurações da calibração: velocidade de agitação: 750 rpm; temperatura: 37 °C; ganho para sensor: 2; tensão de polarização: 800 mV; e intervalo de registro dos dados: 2,0 s.
   4. Para carregar a calibração, clique duas vezes na caixa Pos Calib no canto inferior. Abra a calibração realizada na etapa 2.2 (clique em Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File), e clique em Calibrar e Copy to Clipboard.
      NOTA: A caixa POS Calib mudará de amarelo para verde. Os dados são exibidos em gráficos de fluxo de oxigênio corrigido por volume (Layout 05 Fluxo por Volume não corrigido). Diferentes layouts estão disponíveis no Oxygraph > Layout.
   5. Adicionar 5 μL de difosfato de adenosina 0,5 M (ADP), 10 μL de glutamato 2 M e 2,5 μL de malato 0,4 M (concentrações finais: 1,25 mM, 10 mM e 0,5 mM). Meça o consumo de oxigênio até que o sinal se estabilize.
      NOTA: As microseringas Hamilton de precisão são utilizadas para injeção através da porta de carregamento na rolha. Use uma seringa por medicamento para evitar contaminação cruzada. Clique em F4 para se registrar e marcar no registro de oxigênio quando um tratamento é adicionado.
      NOTA: Os substratos são preparados em água ultrapura e armazenados a −20 °C por 3 meses.
   6. Tritato adicionando 1 μL de digitonina 10 mM em etapas sucessivas até que o consumo de oxigênio atinja um nível máximo.
      NOTA: A lavagem completa com água, etanol 70% e etanol 100% é essencial se a mesma câmara for usada para dois experimentos no mesmo dia.
      NOTA: Digitonin é preparado em água ultrapura e armazenado a -20 °C por 3 meses.
4. Protocolo de rotina de avaliação respiratória de espermatozoides intactos e permeabilizados (complexo I ou complexo II)
   1. Abra a câmara e aspirar o meio para dentro.
   2. Carregar na câmara pelo menos 24 x 10 6 e não mais do que 70 x 10⁶ espermatozoides em um volume final de 2 mL de BWW (análise de células intactas) ou MRM (análise de células permeabilizadas).
   3. Iniciar a experiência com as mesmas definições da calibração (isto é descrito no passo 2.3.3).
   4. Carregue a calibração efectuada no passo 2.2 conforme descrito no passo 2.3.4.
   5. Registrar a respiração das células por pelo menos 5 min até que um sinal estável seja obtido. Essa medida corresponde à respiração basal em células intactas.
   6. Se a experiência for com células intactas, avance para o passo 2.4.9. Para células permeabilizadas, injetar 4,5 μL de digitonina 10 mM (concentração final: 22,5 μM). Permeabilizar as células por 5 min.
   7. Adicionar os substratos: 10 μL de glutamato 2 M e 2,5 μL de malato 0,4 M (concentrações finais: 10 mM e 0,5 mM, respectivamente) para o complexo I ou 20 μL de succinato 1 M (concentração final: 10 mM) para o complexo II. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize. Este é o estado 4, que significa respiração suportada pelo complexo basal I ou complexo basal II na ausência de ADP.
      NOTA: Os substratos são preparados em água ultrapura e armazenados a −20 °C por 3 meses.
   8. Injetar 5 μL de ADP 0,5 M (concentração final: 1,25 mM). Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize. A adição de ADP aumenta o sinal correspondente ao consumo máximo de oxigênio através do complexo I ou complexo II (estado 3, em células permeabilizadas).
   9. Adicionar 1 μL de 4 mg/mL de oligomicina (concentração final: 2 μg/mL), um inibidor da ATP sintetase. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal diminua e se estabilize.
      NOTA: A oligomicina é preparada em etanol e armazenada a -20 °C durante 3 meses.
   10. Titular adicionando 1 μL de 0,1 mM a 1 mM de cianeto de carbonila-P-trifluorometoxi-fenilhidrazona (FCCP) em etapas sucessivas até atingir uma taxa máxima de respiração desacoplado. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal aumente e se estabilize.
       NOTA: O FCCP é preparado em etanol e armazenado a -20 °C durante 3 meses.
   11. A concentração final de FCCP é dependente da amostra. Pare de injetar a droga quando o consumo de oxigênio começa a diminuir.
   12. Finalmente, injetar 1 μL de antimicina A 5 mM (concentração final de 2,5 μM). Trata-se de um inibidor do complexo III para discriminar o consumo mitocondrial e o consumo residual de oxigênio (respiração não mitocondrial). Para a análise do complexo I, adicionar 1 μL de rotenona 1 mM (concentração final de 0,5 μM), um inibidor desse complexo, em vez de AA. Meça o consumo de oxigênio até que o sinal diminua e se estabilize.
       NOTA: Os medicamentos são preparados em etanol e armazenados a -20 °C por 3 meses.

3. Extração e análise dos dados

Figura 2: Aquisição dos parâmetros respiratórios de um experimento de respirometria de alta resolução. (A,B) Representações esquemáticas dos gráficos obtidos, conforme descrito na Figura 1, para células intactas e permeabilizadas, respectivamente. Esses parâmetros foram descritos^{previamente15}. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Arraste o mouse pressionando o botão esquerdo do mouse e a tecla Shift para selecionar regiões onde o fluxo de oxigênio por volume correlacionado (inclinação Y2 O2 uncorr., linha vermelha) é estável após a injeção de um substrato ou inibidor. A Figura 2 mostra os diferentes parâmetros obtidos a partir do registro descrito^{anteriormente15}.
   NOTA: Os parâmetros dependem do experimento; todos eles: respiração basal em células intactas e respiração na presença de glutamato/malato ou succinato (estado 4), ADP (estado 3), oligomicina (vazamento de prótons), FCCP (taxa respiratória máxima), rotenona/AA (respiração não mitocondrial). Nas células permeabilizadas, a respiração basal corresponde ao estado 3.
2. Clique nas janelas Marcas > Estatísticas e exporte os dados.
3. Normalizar os dados obtidos por 1 milhão de espermatozoides. As unidades das encostas são células pmolO₂·s−1·mL−¹·10⁻⁶.
4. Subtrair o consumo de oxigênio não mitocondrial de todos os valores antes de calcular os índices.
5. Calcule os índices usando as várias equações descritas anteriormente¹⁵:
   

Resultados

Determinação da concentração ótima de digitonina em espermatozoides
Neste protocolo, apresentamos o uso da HRR para monitorar em tempo real as mudanças no OXPHOS em espermatozoides humanos. Uma vez que o método pode ser usado para analisar espermatozoides intactos ou permeabilizados por digitonina, apresentamos primeiramente a padronização da concentração de digitonina necessária para permeabilizar os espermatozoides (Figura 3).

A d...

Discussão

A HRR depende criticamente de várias etapas: (a) a manutenção do equipamento, (b) a calibração precisa dos sensores de oxigênio, (c) a titulação do desacoplador²⁶ e, finalmente, (d) o uso adequado de índices que representem a função mitocondrial. A manutenção do equipamento é fundamental. Recomenda-se substituir as membranas do sensor polarográfico de oxigênio regularmente e corrigir o fundo instrumental. A lavagem extensiva após a coleta de espermatozoides das câmaras é essenci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700