Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Resumen

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Resumen

La calidad del semen a menudo se estudia mediante análisis de semen de rutina, que es descriptivo y a menudo no concluyente. La infertilidad masculina se asocia con una alteración de la actividad mitocondrial de los espermatozoides, por lo que la medición de la función mitocondrial de los espermatozoides es un indicador de la calidad del esperma. La respirometría de alta resolución es un método para medir el consumo de oxígeno de células o tejidos en un sistema de cámara cerrada. Esta técnica se puede implementar para medir la respiración en espermatozoides humanos y proporciona información sobre la calidad e integridad de las mitocondrias de los espermatozoides. La respirometría de alta resolución permite que las células se muevan libremente, lo que supone una ventaja a priori en el caso de los espermatozoides. Esta técnica se puede aplicar con espermatozoides intactos o permeabilizados y permite el estudio de la función mitocondrial de los espermatozoides intactos y la actividad de los complejos de cadenas respiratorias individuales. El instrumento oxígrafo de alta resolución utiliza sensores para medir la concentración de oxígeno junto con un software sensible para calcular el consumo de oxígeno. Los datos se utilizan para calcular los índices respiratorios en función de los índices de consumo de oxígeno. En consecuencia, los índices son las proporciones de dos tasas de consumo de oxígeno y se normalizan internamente al número de células o masa proteica. Los índices respiratorios son un indicador de la función y disfunción mitocondrial de los espermatozoides.

Introducción

Se estima que la infertilidad masculina representa entre el 40% y el 50% de todos los casos de infertilidad en las parejas¹. El análisis de semen convencional juega un papel crucial en la determinación de la fertilidad masculina; sin embargo, aproximadamente el 15% de los hombres infértiles tienen parámetros espermatozoides normales². Además, el análisis rutinario del semen proporciona información limitada sobre la función de los espermatozoides y no refleja defectos sutiles de los espermatozoides³.

Las mitocondrias de los espermatozoides tienen una estructura especial,....

Protocolo

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figura 1: Flujo de trabajo para la respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos intactos y permeabilizados. El protocolo se dividió en cuatro pasos diferentes: 1) preparación de la muestra, 2) calibración de oxígeno en el instrumento Oroboros....

Resultados

Determinación de la concentración óptima de digitonina en los espermatozoides
En este protocolo, presentamos el uso de HRR para monitorizar en tiempo real los cambios en OXPHOS en espermatozoides humanos. Dado que el método se puede utilizar para analizar espermatozoides intactos o permeabilizados con digitonina, primero presentamos la estandarización de la concentración de digitonina necesaria para permeabilizar los espermatozoides (Figura 3).

Discusión

La HRR depende críticamente de varios pasos: (a) el mantenimiento del equipo, (b) la calibración precisa de los sensores de oxígeno, (c) la valoración del desacoplador²⁶ y, finalmente, (d) el uso adecuado de índices representativos de la función mitocondrial. El mantenimiento del equipo es crucial. Se recomienda reemplazar las membranas del sensor polarográfico de oxígeno con regularidad y corregir el fondo instrumental. El lavado exhaustivo después de la recolección de espermatozoides d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700