Респирометрия высокого разрешения для оценки функции митохондрий в сперматозоидах человека

Резюме

Анализ митохондриальной функции сперматозоидов с помощью респирометрии высокого разрешения позволяет измерять потребление кислорода свободно движущимися сперматозоидами в замкнутой камере. Метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека, что дает информацию о митохондриальных характеристиках и целостности сперматозоидов.

Аннотация

Качество спермы часто изучается с помощью рутинного анализа спермы, который является описательным и часто неубедительным. Мужское бесплодие связано с измененной митохондриальной активностью сперматозоидов, поэтому измерение митохондриальной функции сперматозоидов является показателем качества спермы. Респирометрия высокого разрешения — это метод измерения потребления кислорода клетками или тканями в системе с закрытой камерой. Этот метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека и предоставляет информацию о качестве и целостности митохондрий сперматозоидов. Респирометрия с высоким разрешением позволяет клеткам свободно двигаться, что является априорным преимуществом в случае сперматозоидов. Этот метод может применяться с интактными или пермеабилизированными сперматозоидами и позволяет исследовать интактную функцию митохондрий сперматозоидов и активность отдельных комплексов дыхательной цепи. Оксиграф высокого разрешения использует датчики для измерения концентрации кислорода в сочетании с чувствительным программным обеспечением для расчета потребления кислорода. Полученные данные используются для расчета дыхательных индексов на основе коэффициентов потребления кислорода. Следовательно, индексы представляют собой пропорции двух скоростей потребления кислорода и внутренне нормируются к количеству клеток или массе белка. Дыхательные индексы являются индикатором митохондриальной функции и дисфункции сперматозоидов.

Введение

По оценкам, мужское бесплодие составляет 40-50% всех случаев бесплодия в парах¹. Обычный анализ спермы играет решающую роль в определении мужской фертильности; Тем не менее, примерно 15% бесплодных мужчин имеют нормальные параметры сперматозоидов². Кроме того, рутинный анализ спермы дает ограниченную информацию о функции сперматозоидов и не отражает малозаметные дефекты сперматозоидов³.

Митохондрии сперматозоидов имеют особое строение, так как расположены в виде спиральной оболочки вокруг жгутиков. Митохондриальная оболочка содержит переменное число митохондрий, соединенных межмитохондриальными линкерами и закрепленных в цитоскелете упорядоченными белковыми расположениями на внешней митохондриальной мембране ^4,5. Такая структура особенно затрудняет выделение митохондрий сперматозоидов. Поэтому в большинстве исследований митохондриальной функции сперматозоидов используют анализ in situ или демембрированных сперматозоидов⁶.

Митохондриальная структура и функции сперматозоидов последовательно связаны с мужским бесплодием 7,8,9,10,11, что позволяет предположить^, что анализ структуры и функции этих органелл может быть хорошим кандидатом для включения в анализ спермы.

Митохондрии играют важную роль в клеточном энергетическом метаболизме, в частности, используя кислород для производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). В сперматозоидах, в частности, источник АТФ (гликолиз против OXPHOS) является спорным, и большая часть данных остается спорной и зависит от различных экспериментальных подходов 4,12,13. Измерения дыхания с помощью оксиметрии дают важное представление о дыхательной способности митохондрий, целостности митохондрий и энергетическом метаболизме клетки^14,15,16. Традиционно этот метод выполнялся с использованием кислородного электрода Кларка – прибора, который использовался для измерения митохондриального дыхания более 50^лет. Кроме того, было проанализировано потребление кислорода митохондриями сперматозоидов с помощью классического кислородного электрода Кларка ^19,20,21. Респирометрия высокого разрешения (HRR) с использованием оксиграфов (Oroboros) обеспечивает более высокую чувствительность, чем использование классических респирометрических приборов²². Оксиграфы состоят из двух камер с инжекционными портами, и каждая камера оснащена полярографическим датчиком кислорода. С помощью этого метода можно анализировать тканевые слайды, клетки и изолированные митохондриальные суспензии. Образец непрерывно перемешивается в камере, и во время эксперимента измеряется потребление кислорода, а скорость кислорода рассчитывается с помощью специального программного обеспечения. Камеры демонстрируют пониженную утечку кислорода, что является преимуществом по сравнению с обычными кислородными электродными устройствами ^14,23.

Как и в случае с другими клетками, в случае сперматозоидов чувствительность оборудования HRR выше, чем для обычной респирометрии, что означает, что оборудование HRR может быть использовано для анализа ограниченного количества интактных или пермеабилизированных сперматозоидов. Существует две основные стратегии оценки митохондриальной функции сперматозоидов с помощью HRR: (а) измерение потребления кислорода в интактных клетках, которое включает воспроизведение дыхательной функции в среде, содержащей субстраты, такие как глюкоза, или (б) измерение потребления кислорода в пермеабилизированных клетках с использованием одного из комплексов OXPHOS с добавлением специфических субстратов для мониторинга каждой функции отдельно.

В настоящем исследовании мы описываем использование HRR для определения митохондриального дыхания в сперматозоидах человека.

протокол

Эксперименты были одобрены Комитетом по этике Медицинского факультета Университета Республики в Монтевидео, Уругвай.

Рисунок 1: Рабочий процесс для респирометрии высокого разрешения для оценки функции митохондрий в интактных и пермеабилизированных сперматозоидах человека. Протокол был разделен на четыре этапа: 1) подготовка образца, 2) калибровка кислорода в приборе «Ороборос», 3) измерение потребления кислорода для интактных и пермеабилизированных ячеек и 4) извлечение данных из оборудования и анализ. Сокращения: CASA = компьютерный анализ спермы; BWW = Biggers Whitten Whittingham средний; MRM = среда митохондриального дыхания; АДФ = аденозиндифосфат; FCCP = карбонильцианид --трифторметоксифенилгидразон; AA = антимицин А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс измерения потребления кислорода в сперматозоидах с помощью HRR показан на рисунке 1. Информация о материалах, оборудовании и реактивах, используемых в протоколе, представлена в Таблице материалов.

1. Пробоподготовка

1. Отбор проб
   1. Соберите свежеэякулированную человеческую сперму путем мастурбации после рекомендуемого 3-дневного воздержания в стерильном пластиковом контейнере. Немедленно транспортируйте образцы в лабораторию.
   2. Инкубируют образцы в течение 30-60 мин при комнатной температуре (RT) до полного разжижения²⁴.
   3. После сжижения храните образцы при температуре 37 °C до начала эксперимента.
2. Оценка сперматозоидов с помощью компьютерного анализа спермы (CASA)
   1. Смешайте образец и загрузите 7 мкл в предварительно разогретую камеру для подсчета сперматозоидов.
   2. Поместите камеру на предварительно нагретый (37 °C) предметный столик микроскопа прямого света.
   3. Откройте компьютеризированное программное обеспечение для анализа спермы и войдите в модуль подвижности и концентрации спермы (нажмите на Mot).
   4. Выберите конфигурацию, соответствующую состоянию сперматозоидов человека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация должна быть адаптирована к типу и глубине камеры, а также к видам образцов и системе CASA.
   5. Случайным образом проанализируйте 10 различных полей в камере, нажав на кнопку «Анализировать ».
   6. Нажмите « Результаты », чтобы получить концентрацию и подвижность образца.
3. Подготовка клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если HRR не откалиброван, начните с шагов 2.1-2.2 перед подготовкой ячеек (шаг 1.3). Важно измерять потребление кислорода сразу после того, как сперматозоиды ресуспендируют в среде.
   1. Центрифугируют образцы при 400 x g в течение 10 мин при RT.
   2. Удалите семенную плазму и ресуспендируйте сперматозоиды в 2 мл Biggers Whitten Whittingham (BWW) для экспериментов с интактными клетками или митохондриальной дыхательной средой (MRM) для исследований с пермеабилизированными клетками. Составы сред приведены в таблице 1.
   3. Повторите шаги, описанные в шаге 1.2, для исследования концентрации сперматозоидов.

2. Респирометрия высокого разрешения: анализ OXPHOS

ПРИМЕЧАНИЕ: HRR интегрирует высокочувствительные оксиграфы (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Инсбрук, Австрия) с программным обеспечением (DatLab, версия 4.2; Ороборос Инструментс ГмбХ). Экспериментальные данные отображаются в виде зависимости концентрации кислорода от времени (в виде пмоль O₂/10⁶ клеток·мин⁻¹) и в виде преобразований этих данных в реальном времени, что позволяет экспериментатору отслеживать дыхание (потребление кислорода, поток кислорода) биологических и биохимических образцов во время эксперимента. HRR может быть использован для отслеживания дыхания живых и подвижных клеток, что особенно полезно для сперматозоидов, подвижность которых связана с качеством сперматозоидов и потенциалом фертильности. В лаборатории используется HRR Oroboros Oxygraph 2-k, Oroboros Instruments, с двумя камерами. Шаги, описанные в этом протоколе, должны выполняться независимо для обеих камер объемом 2 мл.

1. Подготовка оборудования
   1. Включите HRR и подключите его к программному обеспечению для респирометрии (DatLab) для сбора и анализа данных.
   2. Замените 70% этанол в камере оксиграфа на ddH₂O. Непрерывно перемешивайте его магнитной мешалкой в камере со скоростью 750 об/мин. Дайте ему постоять 10 минут, а затем отсосите двойную дистилляцию (dd) H₂O.
   3. Промойте камеру три раза с ddH₂O в течение 5 минут каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления оставшегося этанола из камер. Сперматозоиды очень чувствительны к этанолу. Запись может быть скомпрометирована, если пропустить этот шаг.
2. Калибровка лямбда-зондов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура калибровки немного отличается в зависимости от прибора. Выполняют воздушную калибровку полярографического датчика кислорода, как описано изготовителем²⁵. В этом разделе кратко описан протокол калибровки.
   1. Удалите ddH 2 O и пипетку₂мл той же среды, которая использовалась для подготовки клеток, в камеру. Установите пробки, оставив пузырь воздухообмена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно знать объем камеры, чтобы определить точный объем необходимой среды.
   2. Запишите значения калибровки кислорода (нажмите на Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp), чтобы контролировать производительность мембраны датчика, перемешивая среду с помощью мешалки при 750 об/мин в течение не менее 30 минут при 37 °C. Используйте другие настройки, как уже упоминалось: усиление для датчика: 2; поляризационное напряжение: 800 мВ; Интервал записи данных: 2,0 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается получение наклона_O2 без коррекции (красная линия) в пределах ±2 пмоль∙с⁻1∙мл⁻¹ при стабильном сигнале от полярографического датчика.
   3. Перетащите мышь, удерживая левую кнопку мыши и клавишу Shift, чтобы выбрать область, где изменение концентрации кислорода (концентрация Y1 O2, синяя линия) стабильно.
   4. Откройте окно O₂ Calibration (нажмите на Oxygraph > O2 Calibration). В разделе «Калибровка воздуха» измените выбранную метку на регион, выбранный на шаге 2.2.3. Завершите, нажав « Калибровка» и «Копировать в буфер обмена».
   5. Остановите запись и сохраните, нажав «Оксиграф» > « Ok Control» > «Сохранить и отключить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот набор данных должен быть сохранен, чтобы его можно было использовать во всех экспериментах дня. Калибровка выполняется только один раз в день для каждого носителя.
3. Дигитонин-пермеабилизационное титрование
   1. Откройте камеру и аспирируйте среду внутри.
   2. Загрузите в камеру не менее 24 х 10 6 и не более 70 х 10⁶ сперматозоидов в конечный объем 2 мл МРМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно измерить количество клеток в камере, чтобы отрегулировать потребление кислорода в конце эксперимента. Меньшее количество клеток, чем рекомендуется, не может быть измерено.
   3. Закройте камеру, протолкнув пробки до упора, и аспирируйте оставшуюся жидкость наверху. Начните эксперимент с теми же настройками, что и для калибровки: скорость перемешивания: 750 об/мин; температура: 37 °C; усиление для датчика: 2; поляризационное напряжение: 800 мВ; и интервал записи данных: 2,0 с.
   4. Чтобы загрузить калибровку, дважды щелкните по окошку Pos Calib в нижнем углу. Откройте калибровку, выполненную на шаге 2.2 (нажмите «Оксиграф» > « Калибровка O2» > «Копировать из файла»), и нажмите «Калибровка и копирование в буфер обмена».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коробка POS Calib изменится с желтого на зеленый. Данные отображаются в виде графиков расхода кислорода с поправкой на объем (Layout 05 Flux per Volume uncorrected). В Oxygraph > Layout доступны различные макеты.
   5. Добавьте 5 мкл 0,5 М аденозиндифосфата (АДФ), 10 мкл 2 М глутамата и 2,5 мкл 0,4 М малата (конечные концентрации: 1,25 мМ, 10 мМ и 0,5 мМ). Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не стабилизируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прецизионные микрошприцы Hamilton используются для инъекций через загрузочное отверстие в пробке. Используйте один шприц для каждого препарата, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Нажмите на F4 , чтобы зарегистрироваться, и отметьте в кислородном регистре добавление процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстраты готовят в сверхчистой воде и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
   6. Тритат путем добавления 1 мкл 10 мМ дигитонина в последовательных шагах до тех пор, пока потребление кислорода не достигнет максимального уровня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная промывка водой, 70% этанола и 100% этанолом необходима, если одна и та же камера используется для двух экспериментов в один и тот же день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дигитонин готовят в сверхчистой воде и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
4. Протокол рутинной дыхательной оценки интактных и пермеабилизированных сперматозоидов (комплекс I или комплекс II)
   1. Откройте камеру и аспирируйте среду внутри.
   2. Загрузите в камеру не менее 24 х 10 6 и не более 70 х 10⁶ сперматозоидов в конечном объеме 2 мл BWW (анализ интактных клеток) или MRM (анализ пермеабилизированных клеток).
   3. Начните эксперимент с теми же настройками, что и для калибровки (это описано в шаге 2.3.3).
   4. Загрузите калибровку, выполненную на шаге 2.2, как описано в шаге 2.3.4.
   5. Записывайте дыхание клеток не менее 5 мин до получения стабильного сигнала. Этот показатель соответствует базальному дыханию в интактных клетках.
   6. Если эксперимент проводится с интактными клетками, переходите к шагу 2.4.9. Для пермеабилизированных клеток вводят 4,5 мкл 10 мМ дигитонина (конечная концентрация: 22,5 мкМ). Пермеабилизируйте клетки в течение 5 мин.
   7. Добавьте субстраты: 10 мкл 2 М глутамата и 2,5 мкл 0,4 М малата (конечные концентрации: 10 мМ и 0,5 мМ соответственно) для комплекса I или 20 мкл 1 М сукцината (конечная концентрация: 10 мМ) для комплекса II. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется. Это состояние 4, что означает опорное дыхание базального комплекса I или базального комплекса II при отсутствии АДФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстраты готовят в сверхчистой воде и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
   8. Ввести 5 мкл 0,5 М АДФ (конечная концентрация: 1,25 мМ). Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется. Добавление АДФ увеличивает сигнал, соответствующий максимальному потреблению кислорода через комплекс I или комплекс II (состояние 3, в пермеабилизированных клетках).
   9. Добавьте 1 мкл 4 мг/мл олигомицина (конечная концентрация: 2 мкг/мл), ингибитора АТФ-синтетазы. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не уменьшится и не стабилизируется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Олигомицин готовят в этаноле и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
   10. Титрование путем добавления от 1 мкл от 0,1 мМ до 1 мМ карбонилцианида--трифторметоксифенилгидразона (FCCP) в последовательные этапы до достижения максимальной скорости несвязанного дыхания. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не усилится и не стабилизируется.
       ПРИМЕЧАНИЕ: FCCP готовят в этаноле и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
   11. Конечная концентрация FCCP зависит от образца. Прекратите вводить препарат, когда потребление кислорода начнет снижаться.
   12. Наконец, введите 1 мкл антимицина А 5 мМ (конечная концентрация 2,5 мкМ). Это комплексный ингибитор III для различения митохондриального и остаточного потребления кислорода (немитохондриальное дыхание). Для анализа комплекса I добавляют 1 мкл 1 мМ ротенона (конечная концентрация 0,5 мкМ), ингибитора этого комплекса, вместо АА. Измеряйте расход кислорода до тех пор, пока сигнал не уменьшится и не стабилизируется.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты готовят в этаноле и хранят при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.

3. Извлечение и анализ данных

Рисунок 2: Получение параметров дыхания из эксперимента по респирометрии с высоким разрешением. (A,B) Схематические изображения графиков, полученных, как описано на рисунке 1, для интактных и пермеабилизированных клеток соответственно. Эти параметры были описаны ранее¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

1. Перетащите мышь, нажав левую кнопку мыши и клавишу Shift, чтобы выбрать области, где поток кислорода на объем коррелирует (Y2 O2 наклон некоррелированный, красная линия) стабилен после введения субстрата или ингибитора. На рисунке 2 показаны различные параметры, полученные из ранее описанного регистра¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры зависят от эксперимента; все они следующие: базальное дыхание в интактных клетках и дыхание в присутствии глутамата/малата или сукцината (состояние 4), АДФ (состояние 3), олигомицина (утечка протонов), FCCP (максимальная частота дыхания), ротенон/АА (немитохондриальное дыхание). В пермеабилизированных клетках базальное дыхание соответствует состоянию 3.
2. Нажмите на окна Метки > Статистика и экспортируйте данные.
3. Нормализуйте полученные данные на 1 миллион сперматозоидов. Единицами наклона являются пмольО₂·с−1·мл−¹·мл⁻¹·¹⁰⁻⁶ клеток.
4. Вычтите немитохондриальное потребление кислорода из всех значений перед расчетом индексов.
5. Рассчитайте индексы, используя различные уравнения, описанные ранее¹⁵:
   

Результаты

Определение оптимальной концентрации дигитонина в сперматозоидах
В этом протоколе мы представляем использование HRR для мониторинга изменений OXPHOS в сперматозоидах человека в режиме реального времени. Поскольку метод может быть использован для анализа интактных или дигито?...

Обсуждение

HRR критически зависит от нескольких этапов: (а) техническое обслуживание оборудования, (б) точная калибровка датчиков кислорода, (в) титрование развязки²⁶ и, наконец, (г) адекватное использование индексов, представляющих митохондриальную функцию. Техническое обслуживание об?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700