Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Zusammenfassung

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Zusammenfassung

Die Samenqualität wird oft durch eine routinemäßige Samenanalyse untersucht, die beschreibend und oft nicht schlüssig ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist mit einer veränderten mitochondrialen Aktivität der Spermien verbunden, so dass die Messung der mitochondrialen Funktion der Spermien ein Indikator für die Spermienqualität ist. Die hochauflösende Respirometrie ist eine Methode zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Zellen oder Geweben in einem geschlossenen Kammersystem. Diese Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden und liefert Informationen über die Qualität und Integrität der Spermienmitochondrien. Die hochauflösende Respirometrie ermöglicht es den Zellen, sich frei zu bewegen, was bei Spermien a priori von Vorteil ist. Diese Technik kann mit intakten oder permeabilisierten Spermien angewendet werden und ermöglicht die Untersuchung der intakten Mitochondrienfunktion der Spermien und der Aktivität einzelner Atmungskettenkomplexe. Das hochauflösende Oxygraph-Gerät verwendet Sensoren zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Verbindung mit einer empfindlichen Software zur Berechnung des Sauerstoffverbrauchs. Die Daten werden verwendet, um Atmungsindizes auf der Grundlage der Sauerstoffverbrauchsverhältnisse zu berechnen. Folglich sind die Indizes die Anteile von zwei Sauerstoffverbrauchsraten und werden intern auf die Zellzahl oder Proteinmasse normiert. Die Atmungsindizes sind ein Indikator für die mitochondriale Funktion und Dysfunktion der Spermien.

Einleitung

Es wird geschätzt, dass männliche Unfruchtbarkeit 40%-50% aller Fälle von Unfruchtbarkeit bei Paaren ausmacht¹. Die konventionelle Samenanalyse spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der männlichen Fruchtbarkeit. Etwa 15 % der unfruchtbaren Männer haben jedoch normale Spermienparameter². Darüber hinaus liefert die routinemäßige Samenanalyse nur begrenzte Informationen über die Spermienfunktion und spiegelt keine subtilen Spermiendefekte wider³.

Spermienmitochondrien haben eine besondere Struktur, da sie als spiralförmige Hülle um die Geißeln angeordnet sind.....

Protokoll

Die Experimente wurden von der Ethikkommission der Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay, genehmigt.

Abbildung 1: Arbeitsablauf für hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion in intakten und permeabilisierten menschlichen Spermien. Das Protokoll wurde in vier verschiedene Schritte unterteilt: 1) Vorbereitung der Probe, 2) Sauerstoffkalibrierung im Oroboros-Instru....

Diskussion

Die HRR hängt entscheidend von mehreren Schritten ab: (a) der Wartung der Geräte, (b) der genauen Kalibrierung der Sauerstoffsensoren, (c) der Entkopplertitration²⁶ und schließlich (d) der angemessenen Verwendung von Indizes, die die mitochondriale Funktion darstellen. Die Wartung der Geräte ist von entscheidender Bedeutung. Es wird empfohlen, die Membranen des polarographischen Sauerstoffsensors regelmäßig auszutauschen und den instrumentellen Untergrund zu korrigieren. Ein ausgiebiges Wasc.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700