Respirométrie à haute résolution pour évaluer la fonction mitochondriale chez les spermatozoïdes humains

Résumé

L’analyse de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes par respirométrie à haute résolution permet de mesurer la consommation d’oxygène des spermatozoïdes se déplaçant librement dans un système à chambre fermée. La technique peut être appliquée pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains, ce qui fournit des informations sur les caractéristiques et l’intégrité mitochondriales des spermatozoïdes.

Résumé

La qualité du sperme est souvent étudiée par une analyse de routine du sperme, qui est descriptive et souvent peu concluante. L’infertilité masculine est associée à une altération de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes, de sorte que la mesure de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes est un indicateur de la qualité du sperme. La respirométrie à haute résolution est une méthode de mesure de la consommation d’oxygène des cellules ou des tissus dans un système à chambre fermée. Cette technique peut être mise en œuvre pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains et fournit des informations sur la qualité et l’intégrité des mitochondries des spermatozoïdes. La respirométrie à haute résolution permet aux cellules de se déplacer librement, ce qui est un avantage a priori dans le cas des spermatozoïdes. Cette technique peut être appliquée avec des spermatozoïdes intacts ou perméabilisés et permet d’étudier la fonction mitochondriale intacte des spermatozoïdes et l’activité des complexes de chaînes respiratoires individuels. L’instrument oxygraphe haute résolution utilise des capteurs pour mesurer la concentration d’oxygène couplés à un logiciel sensible pour calculer la consommation d’oxygène. Les données sont utilisées pour calculer les indices respiratoires en fonction des ratios de consommation d’oxygène. Par conséquent, les indices sont les proportions de deux taux de consommation d’oxygène et sont normalisés en interne au nombre de cellules ou à la masse protéique. Les indices respiratoires sont un indicateur de la fonction et du dysfonctionnement des mitochondries des spermatozoïdes.

Introduction

On estime que l’infertilité masculine représente 40 à 50 % de tous les cas d’infertilité chez les couples¹. L’analyse conventionnelle du sperme joue un rôle crucial dans la détermination de la fertilité masculine ; Cependant, environ 15 % des hommes infertiles ont des paramètres de sperme normaux². De plus, l’analyse de routine du sperme fournit des informations limitées sur la fonction des spermatozoïdes et ne reflète pas les défauts subtils des spermatozoïdes³.

Les mitochondries des spermatozoïdes ont une structure particulière, car elles sont disposées comme une gain....

Protocole

Les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté de médecine de l’Université de la République de Montevideo, en Uruguay.

Figure 1 : Flux de travail pour la respirométrie à haute résolution afin d’évaluer la fonction mitochondriale dans les spermatozoïdes humains intacts et perméabilisés. Le protocole a été divisé en quatre étapes différentes : 1) la préparation de l’échantillon, 2) l’étalonnage de l’oxygène....

Discussion

La HRR dépend de plusieurs étapes : (a) l’entretien de l’équipement, (b) l’étalonnage précis des capteurs d’oxygène, (c) le titrage du découpleur²⁶, et enfin, (d) l’utilisation adéquate d’indices représentant la fonction mitochondriale. L’entretien de l’équipement est crucial. Il est recommandé de remplacer régulièrement les membranes du capteur d’oxygène polarographique et de corriger le fond instrumental. Un lavage approfondi après le prélèvement des spermatozo.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700