ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

要約

精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。

要約

精液の質は、ルーチンの精液分析によって研究されることが多いが、これは記述的であり、しばしば決定的ではない。男性不妊症は精子のミトコンドリア活動の変化と関連しているため、精子のミトコンドリア機能の測定は精子の質の指標です。高分解能肺活量測定は、密閉チャンバーシステム内の細胞または組織の酸素消費量を測定する方法です。この技術は、ヒト精子の呼吸を測定するために実装することができ、精子ミトコンドリアの品質と完全性に関する情報を提供します。高解像度の肺活法により、細胞は自由に動くことができ、これは精子の場合の 先験的な 利点です。この技術は、無傷または透過処理された精子に適用でき、無傷の精子のミトコンドリア機能および個々の呼吸鎖複合体の活性の研究を可能にします。高解像度の酸素写真機器は、センサーを使用して酸素濃度を測定し、高感度のソフトウェアを組み合わせて酸素消費量を計算します。このデータは、酸素消費比に基づいて呼吸指数を計算するために使用されます。したがって、指数は2つの酸素消費率の比率であり、細胞数またはタンパク質量に内部的に正規化されます。呼吸指数は、精子のミトコンドリア機能と機能障害の指標です。

概要

男性不妊症は、カップルの不妊症の全症例の40%〜50%を占める^{と推定されています1}。従来の精液分析は、男性の生殖能力を決定する上で重要な役割を果たします。しかし、不妊症の男性の約15%は正常な精子パラメータ^{を持っています}2。さらに、ルーチンの精液分析では、精子の機能に関する情報は限られており、精子の微妙な欠損は反映^{されません3。}

精子のミトコンドリアは、べん毛の周りにらせん状の鞘として配置されているため、特別な構造をしています。ミトコンドリア鞘は、ミトコンドリア間リンカーによって連結され、ミトコンドリアの外側膜上の規則正しいタンパク質配列によって細胞骨格に固定された可変数のミトコンドリアを含む^4,5。この構造により、精子のミトコンドリアを単離することが特に困難になります。したがって、精子のミトコンドリア機能に関するほとんどの研究は、in situ分析または脱膜精子^{を使用しています6。}

精子のミトコンドリアの構造と機能は、一貫して男性不^{妊症に関連して}おり....

プロトコル

この実験は、ウルグアイのモンテビデオにあるFacultad de Medicina de la Universidad de la Repúblicaの倫理委員会によって承認されました。

図1:無傷および透過処理されたヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活量測定のワークフロー。 プロトコルは、1)サンプルの調製、2)オロボロス装置での酸素キャリブレーション、3)インタクトおよび透過処理された細胞の酸素消費量測定、および4)装置からのデータ抽出と分析の4つの異なるステップに分かれています。略語:CASA =コンピューター支援精子分析。BWW = ビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム・ミディアム;MRM = ミトコンドリア呼吸媒体;ADP = アデノシン二リン酸;FCCP = シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン;AA = 抗マイシン A.

結果

精子細胞におけるジギトニンの最適濃度の決定
このプロトコルでは、ヒト精子細胞におけるOXPHOSのリアルタイム変化を監視するためのHRRの使用方法を紹介します。この分析法は、インタクトまたはジギトニン透過処理された精子の分析に使用できるため、まず、精子細胞の透過処理に必要なジギトニン濃度の標準化について紹介します(図3)。

ディスカッション

HRRは、(a)機器のメンテナンス、(b)酸素センサーの正確な校正、(c)アンカプラー滴定²⁶、そして最後に、(d)ミトコンドリア機能を表す指標の適切な使用といういくつかのステップに決定的に依存します。機器のメンテナンスは非常に重要です。ポーラログラフ式酸素センサーのメンブレンを定期的に交換し、機器のバックグラウンドを修正することをお勧めします。チャンバ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700