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精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。
精液の質は、ルーチンの精液分析によって研究されることが多いが、これは記述的であり、しばしば決定的ではない。男性不妊症は精子のミトコンドリア活動の変化と関連しているため、精子のミトコンドリア機能の測定は精子の質の指標です。高分解能肺活量測定は、密閉チャンバーシステム内の細胞または組織の酸素消費量を測定する方法です。この技術は、ヒト精子の呼吸を測定するために実装することができ、精子ミトコンドリアの品質と完全性に関する情報を提供します。高解像度の肺活法により、細胞は自由に動くことができ、これは精子の場合の 先験的な 利点です。この技術は、無傷または透過処理された精子に適用でき、無傷の精子のミトコンドリア機能および個々の呼吸鎖複合体の活性の研究を可能にします。高解像度の酸素写真機器は、センサーを使用して酸素濃度を測定し、高感度のソフトウェアを組み合わせて酸素消費量を計算します。このデータは、酸素消費比に基づいて呼吸指数を計算するために使用されます。したがって、指数は2つの酸素消費率の比率であり、細胞数またはタンパク質量に内部的に正規化されます。呼吸指数は、精子のミトコンドリア機能と機能障害の指標です。
男性不妊症は、カップルの不妊症の全症例の40%〜50%を占めると推定されています1。従来の精液分析は、男性の生殖能力を決定する上で重要な役割を果たします。しかし、不妊症の男性の約15%は正常な精子パラメータを持っています2。さらに、ルーチンの精液分析では、精子の機能に関する情報は限られており、精子の微妙な欠損は反映されません3。
精子のミトコンドリアは、べん毛の周りにらせん状の鞘として配置されているため、特別な構造をしています。ミトコンドリア鞘は、ミトコンドリア間リンカーによって連結され、ミトコンドリアの外側膜上の規則正しいタンパク質配列によって細胞骨格に固定された可変数のミトコンドリアを含む4,5。この構造により、精子のミトコンドリアを単離することが特に困難になります。したがって、精子のミトコンドリア機能に関するほとんどの研究は、in situ分析または脱膜精子を使用しています6。
精子のミトコンドリアの構造と機能は、一貫して男性不妊症に関連しており7,8,9,10,11、これらの細胞小器官の構造と機能の分析は、精子分析に含めるための良い候補である可能性があることを示唆しています。
ミトコンドリアは、特に酸素を使用して酸化的リン酸化(OXPHOS)を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成することにより、細胞のエネルギー代謝に重要な役割を果たします。特に精子では、ATPの供給源(解糖系対OXPHOS)が論争されており、データの多くは議論の余地があり、さまざまな実験的アプローチに依存しています4,12,13。酸素濃度測定による呼吸の測定は、ミトコンドリアの呼吸能力、ミトコンドリアの完全性、および細胞のエネルギー代謝に関する重要な洞察を提供します14,15,16。伝統的に、この技術は、50年以上にわたってミトコンドリア呼吸を測定するために使用されてきた機器であるクラーク酸素電極を使用して行われてきました17,18。さらに、精子のミトコンドリア酸素消費量は、古典的なクラーク酸素電極19,20,21を使用して分析されています。オキシグラフ(オロボロス)を用いた高分解能肺活量測定(HRR)は、従来の肺活量測定装置を使用するよりも高い感度を提供する22。オキシグラフは注入ポートを備えた2つのチャンバーで構成されており、各チャンバーにはポーラログラフ式酸素センサーがあります。この技術により、組織スライド、細胞、および単離されたミトコンドリア懸濁液を分析することができます。試料をチャンバー内で連続的に攪拌し、実験中に酸素消費量を測定し、特定のソフトウェアを使用して酸素率を計算します。チャンバは酸素漏れの低減を示し、これは従来の酸素電極デバイス14,23に対する利点である。
他の細胞と同様に、精子の場合、HRR装置の感度は従来の肺活法よりも高いため、HRR装置は限られた数の無傷または透過処理された精子細胞の分析に使用できます。HRRによる精子のミトコンドリア機能の評価には、主に2つの戦略があります:(a)グルコースなどの基質を含む培地で呼吸機能を再現することを含む無傷細胞内の酸素消費量を測定すること、または(b)OXPHOS複合体の1つを使用して透過処理細胞内の酸素消費量を測定し、特定の基質を追加して各機能を個別に監視します。
本研究では、ヒト精子細胞におけるミトコンドリア呼吸を決定するためのHRRの使用について説明します。
この実験は、ウルグアイのモンテビデオにあるFacultad de Medicina de la Universidad de la Repúblicaの倫理委員会によって承認されました。
図1:無傷および透過処理されたヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活量測定のワークフロー。 プロトコルは、1)サンプルの調製、2)オロボロス装置での酸素キャリブレーション、3)インタクトおよび透過処理された細胞の酸素消費量測定、および4)装置からのデータ抽出と分析の4つの異なるステップに分かれています。略語:CASA =コンピューター支援精子分析。BWW = ビガーズ・ウィッテン・ウィッティンガム・ミディアム;MRM = ミトコンドリア呼吸媒体;ADP = アデノシン二リン酸;FCCP = シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン;AA = 抗マイシン A. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
注:HRRを使用して精子細胞の酸素消費量を測定するためのワークフローを 図1に示します。プロトコルで使用される材料、機器、および試薬に関する情報は、 材料表に記載されています。
1. サンプル調製
2. 高分解能スピロメトリー:OXPHOS分析
注:HRRは高感度オキシグラフ(Oxygraph-2 K;Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria)とソフトウェア(DatLab、バージョン4.2;Gmbh Oroboros Instruments)。実験データは、酸素濃度対時間(O2/106 cells·min-1のpmolとして)およびこれらのデータのリアルタイム変換として表示されるため、実験者は実験中に生物学的および生化学的サンプルの呼吸(酸素消費量、酸素流束)を追跡できます。HRRは、生きた細胞や運動性細胞の呼吸を追跡するために使用でき、その運動性が精子の質と生殖能力に関連している精子に特に有用です。研究室では、2つのチャンバーを備えたHRR Oroboros Oxygraph2-k、Oroboros Instrumentsを使用しています。このプロトコルに記載されている手順は、両方の 2 mL チャンバーに対して独立して実行する必要があります。
3. データの抽出と分析
図2:高分解能スピロメトリー実験による呼吸パラメータの取得。 (A,B)図1に示した、インタクト細胞と透過処理細胞について得られたグラフの模式図。これらのパラメータは、前述した15で説明した。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
精子細胞におけるジギトニンの最適濃度の決定
このプロトコルでは、ヒト精子細胞におけるOXPHOSのリアルタイム変化を監視するためのHRRの使用方法を紹介します。この分析法は、インタクトまたはジギトニン透過処理された精子の分析に使用できるため、まず、精子細胞の透過処理に必要なジギトニン濃度の標準化について紹介します(図3)。
HRRは、(a)機器のメンテナンス、(b)酸素センサーの正確な校正、(c)アンカプラー滴定26、そして最後に、(d)ミトコンドリア機能を表す指標の適切な使用といういくつかのステップに決定的に依存します。機器のメンテナンスは非常に重要です。ポーラログラフ式酸素センサーのメンブレンを定期的に交換し、機器のバックグラウンドを修正することをお勧めします。チャンバ?...
著者は何も開示していません。
ドナーへのアクセスを許可してくれたFertilab Andrologyクリニック、特にJosé María MontesとAndrea Torrentsに感謝します。資金提供:ACは、Universidad de la República(CSIC_2018、Espacio Interdisciplinario_2021)からの助成金によってサポートされています。追加資金は、Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas(ウルグアイ、PEDECIBA)から得られました。P.I. と R.S. は Universidad de la República (I+D, CSIC 2014;I+D、CSIC 2016、Iniciación a la Investigación、CSIC 2019、FMV_1_2017_1_136490 ANII-ウルグアイ)。P.I. は POS_FMV_2018_1_1007814 と CAP-UDELAR 2020 でサポートされています。図は Biorender.com を使用して示されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
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