نافذة مستقرة للتصوير داخل الجسم للبنكرياس الفئران

Summary

نقدم بروتوكولا للزرع الجراحي لنافذة بصرية مستقرة للتصوير بدقة تحت الخلوية لبنكرياس الفئران ، مما يسمح بإجراء دراسات تسلسلية وطولية للبنكرياس السليم والمريض.

Abstract

علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للبنكرياس معقدة. أمراض البنكرياس ، مثل التهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس الغدي (PDAC) لها معدلات مراضة ووفيات عالية. التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية قوية تمكن من التصوير عالي الدقة للأنسجة في كل من الحالات الصحية والمريضة ، مما يسمح بمراقبة ديناميكيات الخلية في الوقت الفعلي. يمثل IVI لبنكرياس الفئران تحديات كبيرة بسبب الطبيعة الحشوية العميقة والمتوافقة للعضو ، مما يجعله عرضة بشدة للتلف والتحف المتحركة.

الموصوفة هنا هي عملية زرع Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP). يسمح SWIP ب IVI لبنكرياس الفئران في الحالات الصحية الطبيعية ، أثناء التحول من البنكرياس السليم إلى التهاب البنكرياس الحاد الناجم عن السيرولين ، وفي الحالات الخبيثة مثل أورام البنكرياس. بالاقتران مع الخلايا الموسومة وراثيا أو إعطاء الأصباغ الفلورية ، يتيح SWIP قياس ديناميكيات الخلية الواحدة وتحت الخلوية (بما في ذلك الخلية المفردة والهجرة الجماعية) بالإضافة إلى التصوير التسلسلي لنفس المنطقة ذات الاهتمام على مدار عدة أيام.

تعتبر القدرة على التقاط هجرة الخلايا السرطانية ذات أهمية خاصة لأن السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الهائل. يعد فهم الديناميات الفسيولوجية للورم الخبيث في PDAC حاجة حرجة لم تتم تلبيتها وحاسمة لتحسين تشخيص المريض. بشكل عام ، يوفر SWIP استقرارا محسنا للتصوير ويوسع تطبيق IVI في البنكرياس السليم وأمراض البنكرياس الخبيثة.

Introduction

من المحتمل أن تكون أمراض البنكرياس الحميدة والخبيثة مهددة للحياة ، مع وجود فجوات كبيرة في فهم الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بها. التهاب البنكرياس - التهاب البنكرياس - هو السبب الرئيسي الثالث لدخول المستشفيات وإعادة الدخول إلى المستشفى المرتبط بأمراض الجهاز الهضمي في الولايات المتحدة ويرتبط بالمراضة الكبيرة والوفيات والعبء الاجتماعي والاقتصادي¹. يحتل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) المرتبة الثالثة كسبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان 2 ، ويمثل معظم الأورام الخبيثة في البنكرياس³ وينذر بمعدل بقاء ضعيف لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ ^{فقط 2}. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDA....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة باستخدام الفقارية ، بما في ذلك الموافقة المسبقة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في كلية ألبرت أينشتاين للطب (IACUC).

1. تخميل النوافذ

ملاحظة: تخميل الفولاذ المقاوم للصدأ ينظف المعدن من الملوثات ويخلق طبقة أكسيد رقيقة تزيد بشكل كبير من التوافق الحيوي للمعدن مع الأنسجة الرخوة ، حتى بعد التيتانيوم¹⁶.

1. ابدأ عملية التخميل عن طريق غسل إطارات النوافذ البصرية بمحلول منظف نشط إنزيميا بنسبة 1٪ (وزن / حجم).
2. اغمر الإطارات في محلول هيدروكسيد الصوديوم 5٪ (وزن / حجم) عند 70 ....

النتائج

يوضح الشكل 1 ، المقتبس من Du et ^al.15 ، صورا ثابتة من فيلم IVI بفاصل زمني لبنكرياس الفئران. يمكن ملاحظة بعض حركة الأنسجة خلال فترة الاستقرار الأولية (الساعة الأولى من التصوير ، الشكل 1 أ). ومع ذلك ، مع التصوير المستمر بعد فترة الاستقرار هذه (>75 دقيقة) ، لا.......

Discussion

يوفر بروتوكول SWIP الموصوف هنا طريقة محسنة لتثبيت أنسجة البنكرياس من خلال استخدام تقنية سلة الغرزة المتقاطعة. مكنت نوافذ تصوير البطن المبكرة (AIWs) من التصوير داخل الجسم (IVI) للأعضاء الداخلية للبطن ولكنها لم تحد بشكل كاف من حركة الأنسجة الرخوة مثل البنكرياس. استجابة لذلك ، طور Park et al. نافذة تصوي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].