Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für die chirurgische Implantation eines stabilisierten optischen Bleibefensters für die subzellulär aufgelöste Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse, das serielle und longitudinale Studien der gesunden und erkrankten Bauchspeicheldrüse ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Physiologie und Pathophysiologie der Bauchspeicheldrüse ist komplex. Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse, wie Pankreatitis und Pankreas-Adenokarzinom (PDAC), weisen eine hohe Morbidität und Mortalität auf. Die Intravital-Bildgebung (IVI) ist eine leistungsstarke Technik, die die hochauflösende Bildgebung von Geweben sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand ermöglicht und eine Echtzeitbeobachtung der Zelldynamik ermöglicht. Die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse stellt aufgrund der tiefen viszeralen und nachgiebigen Natur des Organs eine große Herausforderung dar, was es sehr anfällig für Schäden und Bewegungsartefakte macht.

Hier wird der Prozess der Implantation des Stabilisierten Window für die Intravitale Bildgebung des murinen P-Ankreas (SWIP) beschrieben. Das SWIP ermöglicht die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse in normalen gesunden Zuständen, während der Transformation von der gesunden Bauchspeicheldrüse zu einer akuten Pankreatitis, die durch Cerulein induziert wird, und in malignen Zuständen wie Pankreastumoren. In Verbindung mit genetisch markierten Zellen oder der Verabreichung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht das SWIP die Messung der einzelligen und subzellulären Dynamik (einschließlich Einzelzell- und kollektiver Migration) sowie die serielle Bildgebung derselben interessierenden Region über mehrere Tage.

Die Fähigkeit, die Migration von Tumorzellen zu erfassen, ist von besonderer Bedeutung, da die Hauptursache für die krebsbedingte Mortalität bei PDAC die überwältigende Metastasierungslast ist. Das Verständnis der physiologischen Dynamik der Metastasierung bei PDAC ist ein kritischer ungedeckter Bedarf und entscheidend für die Verbesserung der Patientenprognose. Insgesamt bietet das SWIP eine verbesserte Bildgebungsstabilität und erweitert die Anwendung von IVI bei gesunden Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse und der bösartigen Bauchspeicheldrüse.

Einleitung

Gutartige und bösartige Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse sind potenziell lebensbedrohlich und weisen erhebliche Lücken im Verständnis ihrer Pathophysiologie auf. Pankreatitis – eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse – ist die dritthäufigste Ursache für Krankenhauseinweisungen und Wiedereinweisungen im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen in den USA und ist mit erheblicher Morbidität, Mortalität und sozioökonomischer Belastung verbunden¹. Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), das als dritthäufigste krebsbedingte Todesursache eingestuft wird 2, ist für die meisten Pankreasmalignome^{verantwortlich} 3....

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivierung von Fenstern

HINWEIS: Die Passivierung von Edelstahl reinigt das Metall von Verunreinigungen und erzeugt eine dünne Oxidschicht, die die Biokompatibilität des Metalls mit Weichgeweben erheblich erhöht, sogar über die von Titan¹⁶ hinaus.

1. Beginnen Sie ....

Diskussion

Das hier beschriebene SWIP-Protokoll bietet eine verbesserte Methode zur Stabilisierung des Bauchspeicheldrüsengewebes unter Verwendung einer Kreuzstichkorbtechnik. Frühe abdominale Bildgebungsfenster (AIWs) ermöglichten die intravitale Bildgebung (IVI) der inneren Organe des Abdomens, schränkten aber die Bewegung von Weichteilen wie der Bauchspeicheldrüse nicht ausreichend ein. Als Reaktion darauf entwickelten Park et al. ein Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW), das eine horizontale Metallablage enthält und eine ver.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].