Fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas murin

Résumé

Nous présentons un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique stabilisée à demeure pour l’imagerie à résolution subcellulaire du pancréas murin, permettant des études en série et longitudinales du pancréas sain et malade.

Résumé

La physiologie et la physiopathologie du pancréas sont complexes. Les maladies du pancréas, telles que la pancréatite et l’adénocarcinome pancréatique (PDAC), ont une morbidité et une mortalité élevées. L’imagerie intravitale (IVI) est une technique puissante permettant l’imagerie à haute résolution des tissus à l’état sain et malade, permettant l’observation en temps réel de la dynamique cellulaire. L’IVI du pancréas murin présente des défis importants en raison de la nature viscérale et souple profonde de l’organe, ce qui le rend très sujet aux dommages et aux artefacts de mouvement.

Le processus d’implantation de l’Indowtabilisé S pourl’imagerie intravitale du Pancréas murin (SWIP) est décrit ici. Le SWIP permet l’IVI du pancréas murin dans des états sains normaux, lors de la transformation du pancréas sain en pancréatite aiguë induite par la céruléine, et dans des états malins tels que les tumeurs pancréatiques. En conjonction avec des cellules génétiquement marquées ou l’administration de colorants fluorescents, le SWIP permet de mesurer la dynamique unicellulaire et subcellulaire (y compris la migration unicellulaire et collective) ainsi que l’imagerie en série d’une même région d’intérêt sur plusieurs jours.

La capacité de capturer la migration des cellules tumorales est particulièrement importante car la principale cause de mortalité liée au cancer dans la PDAC est la charge métastatique écrasante. Comprendre la dynamique physiologique des métastases dans la PDAC est un besoin critique non satisfait et crucial pour améliorer le pronostic des patients. Dans l’ensemble, le SWIP améliore la stabilité de l’imagerie et élargit l’application de l’IVI dans le pancréas sain et les maladies malignes du pancréas.

Introduction

Les maladies bénignes et malignes du pancréas peuvent mettre la vie en danger, avec des lacunes considérables dans la compréhension de leur physiopathologie. La pancréatite, c’est-à-dire l’inflammation du pancréas, est la troisième cause majeure d’hospitalisations et de réadmissions liées aux maladies gastro-intestinales aux États-Unis et est associée à une morbidité, une mortalité et^{un fardeau} socio-économique importants. Classé au troisième rang des causes^{de décès par} cancer2, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) représente la plupart des tumeurs malignes du pancréas3 et laisse présager un faible taux de survie à 5 ans de seulement 11 %². La principale cause de mortalité liée au cancer chez les ACPE est le fardeau métastatique écrasant. Malheureusement, la plupart des patients présentent une maladie métastatique. Par conséquent, la compréhension de la dynamique des métastases dans l’ACPE est un besoin essentiel non satisfait dans le domaine de la recherche sur le cancer.

Les mécanismes sous-jacents à l’inflammation et à la cascade métastatique du pancréas sont mal compris. L’un des principaux facteurs contribuant à cette lacune dans les connaissances est l’incapacité d’observer la dynamique cellulaire pancréatique in vivo. L’observation directe de ces dynamiques cellulaires promet de révéler des cibles critiques pour tirer parti et améliorer le diagnostic et le traitement des personnes atteintes d’une maladie pancréatique.

L’imagerie intravitale (IVI) est une technique de microscopie qui permet aux chercheurs de visualiser et d’étudier en temps réel les processus biologiques chez les animaux vivants. L’IVI permet une visualisation directe et à haute résolution de la dynamique intracellulaire et microenvironnementale in vivo et dans l’environnement natif du processus biologique en question. Par conséquent, l’IVI permet d’observer in vivo les processus sains et pathologiques.

Les modalités contemporaines d’imagerie du corps entier telles que l’IRM, la TEP et la TDM offrent d’excellentes vues d’organes entiers et peuvent révéler des pathologies, avant même l’apparition des symptômes cliniques⁴. Ils sont cependant incapables d’atteindre une résolution unicellulaire ou de révéler les premiers stades de la maladie, la pancréatite ou la malignité.

Des recherches antérieures ont utilisé l’IVI à résolution unicellulaire pour observer les maladies bénignes et malignes de la peau^5,6, du sein⁷, du poumon⁸, du foie⁹, du cerveau 10 et des tumeurs pancréatiques 11^, ce qui a permis de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie ¹². Cependant, le pancréas murin pose des obstacles importants à l’obtention d’une résolution unicellulaire à l’aide de l’IVI, principalement en raison de sa localisation viscérale profonde et de sa grande observance. De plus, il s’agit d’un organe ramifié et distribué de manière diffuse dans le mésentère qui se connecte à la rate, à l’intestin grêle et à l’estomac, ce qui le rend difficile d’accès. Le tissu est également très sensible aux mouvements causés par le péristaltisme et la respiration adjacents. La minimisation des mouvements du pancréas est essentielle pour la microscopie à résolution de cellule unique, car les artefacts de mouvement, même de quelques microns, peuvent brouiller et déformer les images, ce qui rend impossible le suivi de la dynamique des cellules individuelles¹³.

Pour réaliser une IVI, une fenêtre d’imagerie abdominale (AIW) doit être implantée chirurgicalement ^9,11. Pour implanter l’AIW chirurgicalement, un cadre de fenêtre métallique est suturé dans la paroi abdominale. Ensuite, l’organe d’intérêt est fixé au cadre à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate. Bien que cela soit suffisant pour certains organes internes rigides (par exemple, le foie, la rate, les tumeurs rigides), les tentatives d’imagerie du pancréas murin sain sont compromises par une stabilité latérale et axiale sous-optimale en raison de la texture souple et de l’architecture complexe du tissu¹⁴. Pour remédier à cette limitation, Park et ^al.14 ont mis au point une fenêtre d’imagerie spécialement conçue pour le pancréas sain. Cette fenêtre d’imagerie du pancréas (PIW) minimise l’influence des mouvements intestinaux et de la respiration en incorporant une étagère métallique horizontale dans le cadre de la fenêtre, juste en dessous de la lamelle, stabilisant le tissu et maintenant son contact avec la vitre de protection. Bien que le PIW offre une stabilité latérale accrue, nous avons constaté que cette fenêtre présente toujours une dérive axiale et empêche en outre l’imagerie de grosses tumeurs solides en raison de l’espace étroit entre l’étagère métallique et la lamelle¹⁵.

Pour remédier à ces limitations, nous avons mis au point le Window tabilisé Spour l’imagerie intravitale du pancréasmurin (SWIP), une fenêtre d’imagerie implantable capable d’obtenir une imagerie stable à long terme du pancréas sain et malade (Figure 1)¹⁵. Ici, nous fournissons un protocole complet pour l’intervention chirurgicale utilisée pour implanter le SWIP. Bien que l’objectif principal ait été d’étudier les mécanismes dynamiques impliqués dans les métastases, cette méthode peut également être utilisée pour explorer divers aspects de la biologie et de la pathologie du pancréas.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été effectuées conformément aux directives et aux règlements pour l’utilisation d’animaux vertébrés, y compris l’approbation préalable du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Albert Einstein College of Medicine.

1. Passivation des fenêtres

REMARQUE : La passivation de l’acier inoxydable nettoie le métal des contaminants et crée une fine couche d’oxyde qui augmente considérablement la biocompatibilité du métal avec les tissus mous, même au-delà de celle du titane¹⁶.

1. Commencez le processus de passivation en lavant les cadres optiques des fenêtres avec une solution détergente enzymatiquement active à 1 % (p/v).
2. Plongez les cadres dans une solution d’hydroxyde de sodium à 5 % (p/v) à 70 °C pendant 30 min à l’intérieur d’un bocal en verre.
3. Sortez les cadres et rincez-les à l’eau déminéralisée.
4. Plongez les cadres dans une solution d’acide citrique à 7 % (p/v) à 55 °C pendant 10 min à l’intérieur d’un nouveau bocal en verre.
5. Retirez les cadres et rincez-les à nouveau à l’eau déminéralisée.
6. Répétez l’étape 1.2 et, enfin, rincez une dernière fois les cadres de fenêtre à l’eau déminéralisée.

2. Préparation à l’implantation de la tumeur ou à la chirurgie de la fenêtre

REMARQUE : Pour les études sur les tumeurs pancréatiques, les cellules tumorales doivent être implantées et autorisées à se développer en tumeurs manifestes. Pour visualiser les cellules tumorales in vivo, il est recommandé d’utiliser des cellules génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes telles que Dendra2. L’utilisation d’étiquettes de protéines fluorescentes et lumineuses atténuera les problèmes potentiels d’autofluorescence des tissus. D’autres protéines fluorescentes potentielles, des colorants et des modèles murins fluorescents génétiquement codés qui pourraient être utilisés ont été discutés ailleurs^17,18. Pour éviter la contamination du champ opératoire, effectuez l’intervention chirurgicale dans une hotte ou une armoire à flux laminaire et assurez-vous que des zones distinctes sont utilisées pour la préparation, la chirurgie et la récupération.

1. Avant la chirurgie, stérilisez tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave et, si nécessaire, utilisez un stérilisateur à billes chaudes pour les procédures ultérieures. Assurez-vous que la chirurgie utilise une technique de conseils uniquement.
2. Allumez le coussin chirurgical chauffant et le stérilisateur de billes et attendez qu’il atteigne la température de fonctionnement appropriée. La température du coussin chauffant doit être surveillée à l’aide d’un thermomètre de surface pour éviter les brûlures potentielles. Placez un chiffon stérile sur le coussin chauffant si la température ne peut pas être contrôlée de manière adéquate.
   REMARQUE : La température corporelle pendant les procédures courtes (≤20 min), telles que la tumeur et l’implantation de fenêtre, est peu affectée lors de l’utilisation d’un coussin chirurgical chauffant. Cependant, des périodes d’anesthésie plus longues, comme lors d’une imagerie en accéléré prolongée, nécessitent que la souris soit placée dans une chambre chauffée pour maintenir la température corporelle.
3. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 5 % dans une chambre d’anesthésie.
4. Étape critique : Abaissez l’anesthésie à 2 % une fois que la souris est inconsciente. Surveillez attentivement le niveau d’anesthésie et les signes vitaux de la souris (par exemple, à l’aide d’un oxymètre de pouls)¹⁹.
5. Placez une petite goutte de lubrifiant oculaire sur chaque œil de la souris pour éviter le dessèchement de la cornée.
6. Avant la chirurgie, appliquez généreusement la crème dépilatoire sur la partie supérieure gauche de l’abdomen pour éliminer les poils. Après 20 s, utilisez du papier de soie humidifié pour essuyer fermement les poils et la crème dépilatoire. Répétez le processus au besoin jusqu’à ce que tous les poils soient retirés de la zone chirurgicale.
7. Injecter 10 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg) diluée dans 90 μL de PBS par voie sous-cutanée pour assurer l’analgésie préopératoire.

3. Implantation d’une tumeur du pancréas

1. Préparer des aliquotes de cellules tumorales à la concentration souhaitée (en fonction du temps de doublement des cellules tumorales). Placez la suspension cellulaire dans une seringue à insuline et conservez-la sur de la glace. Pour suivre ce protocole, utiliser 10⁶ cellules tumorales KPC syngéniques 20 en suspension dans un maximum de 50 μL de PBS, en suivant le protocole d’injection orthotopique adapté d’Erstad et^al.21
   REMARQUE : Cette lignée cellulaire injectée à cette concentration produisait régulièrement des tumeurs palpables ou de taille appropriée en 10 à 14 jours. Les sous-clones de cette lignée cellulaire et d’autres lignées cellulaires pancréatiques devraient être évalués pour les concentrations et les délais appropriés pour produire des tumeurs de taille appropriée).
2. Lavez-vous les mains avec un savon antiseptique.
3. Avant chaque nouvelle chirurgie, mettez de nouveaux gants stériles.
4. Transférez la souris dans le capot chirurgical stérile et placez-la dans une position de décubitus latéral droit partiel.
5. Fixez les membres avec du ruban adhésif en papier.
   REMARQUE : L’utilisation correcte des instruments est importante tout au long de la procédure. Des exemples de la façon de tenir les pinces, les ciseaux Castroviejo et l’outil de ramassage par le vide sont présentés à la figure 2A-C.
6. Stériliser l’abdomen avec un antiseptique (Figure 2D).
7. Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en effectuant un test de pincement des orteils.
8. Faites une incision sous-costale gauche de 10 à 15 mm dans la peau à l’aide d’une pince et de ciseaux Castroviejo (Figure 2E).
9. Contrôlez l’hémostase à l’aide de cotons-tiges ou d’un stylo cautériste lorsque cela est jugé nécessaire.
10. Divisez soigneusement le muscle sous-jacent avec des pinces et des ciseaux Castroviejo pour entrer dans le péritoine (Figure 2F).
11. À l’aide de cotons-tiges stériles, extérioriser de manière atraumatique le pancréas et la rate.
12. Écartez le pancréas vers l’extérieur pour qu’il n’y ait pas de plis (Figure 2G).
13. Identifiez le site d’injection de tumeur souhaité dans le corps ou la queue du pancréas (loin des vaisseaux sanguins).
14. Étape critique : Après avoir soigneusement positionné le pancréas, utilisez une pince pour tendre le tissu et insérez l’embout de la seringue à insuline, le biseau vers le haut, dans le site souhaité du pancréas à une profondeur de 4 à 5 mm (Figure 2H).
15. Injectez lentement la solution de cellules tumorales. Recherchez une petite bulle qui confirme une injection réussie (Figure 2I).
16. Remettez délicatement le pancréas dans l’abdomen sans perturber la bulle d’injection de cellules tumorales (Figure 2J).
17. À l’aide de sutures résorbables en polydioxanone 5-0, fermez d’abord la couche musculaire, puis la peau avec des sutures interrompues (Figure 2K-N).
18. Couvrez l’incision avec de la colle cyanoacrylate (Figure 2O), puis remettez la souris dans une cage propre sous une lampe chauffante pour la récupérer. Administrer des antibiotiques dans l’eau potable pour prévenir l’infection. Surveillez les souris et laissez-les se remettre complètement de la chirurgie.
    REMARQUE : Les antibiotiques sont administrés conformément au protocole de l’IACUC. Tous les animaux sont logés individuellement.
19. Laissez la tumeur se développer pendant 10 à 14 jours jusqu’à ce qu’elle soit palpable à travers la paroi abdominale.

4. Chirurgie de la fenêtre du pancréas

1. Lorsque les animaux sont prêts pour l’imagerie, commencez la chirurgie d’implantation de la fenêtre. Pour commencer, lavez-vous les mains avec du savon antiseptique.
2. Avant chaque nouvelle intervention chirurgicale, enfilez des gants stériles neufs.
3. Sur le support chirurgical chauffé, placez la souris en position de décubitus latéral droit pour exposer l’abdomen gauche.
4. Ancrez les membres avant et arrière de la souris à la scène chirurgicale chauffée crânienne et caudale à l’aide de ruban adhésif en papier. Assurez-vous que la rate (sous la peau) est visible dans le champ chirurgical (Figure 3A).
5. Pour maintenir la stérilité, déballez tous les instruments chirurgicaux dans la capuche.
6. Désinfectez le site chirurgical en écouvillonnant la peau de la souris avec une application généreuse d’antiseptique.
7. Assurez-vous que l’animal est complètement anesthésié en effectuant un test de pincement des orteils.
8. Étape critique : Soulevez la peau du quadrant supérieur gauche de l’abdomen avec une pince et faites une incision circulaire de ~10 mm dans la peau et la musculature à l’aide de ciseaux Castroviejo (Figure 3B,C).
9. Contrôlez le saignement et maintenez l’hémostase à l’aide de cotons-tiges ou du stylo cautériste, si nécessaire.
10. Localisez le pancréas, qui est attaché à la rate, et identifiez la direction dans laquelle le pancréas se trouve dans l’incision pour décider où le point de croix de soutien doit être placé.
11. À l’aide de la suture en soie 5-0, placez la première maille à l’endroit souhaité dans la couche musculaire. Attachez cette extrémité avec 3-5 nœuds. (Graphique 3D, E)
12. Continuez à coudre directement sur l’incision. Coupez et laissez une queue de ~5 cm (Figure 3F).
13. Répétez les étapes 4.11 et 4.12 perpendiculairement à la première maille (Figure 3G,H).
14. Étape critique : Soulevez doucement le pancréas et positionnez-le sur le point de croix (Figure 3I,J). Veillez à ne pas endommager le pancréas lors de la manipulation.
15. Étape critique : À l’aide de la suture de soie 5-0, effectuez un point de cordon de bourse à ~1 mm du trou, sur le pourtour, en entrelaçant la couche de peau et de muscle (Figure 3K).
16. Positionnez le cadre de la fenêtre de manière à ce que les bords de l’incision circulaire soient insérés dans la rainure de la fenêtre (Figure 3L).
17. Fixez la fenêtre implantée en attachant fermement la soie 5-0.
18. Chargez 100 μL d’adhésif cyanoacrylate liquide dans la seringue de 1 mL.
19. Séchez le tissu en appliquant un flux délicat d’air comprimé pendant ~10 s.
20. Saisissez le cadre de la fenêtre par son bord extérieur avec une pince et soulevez-le doucement pour assurer la séparation du pancréas de la surface inférieure du cadre de la fenêtre.
21. Étape critique : Distribuer une fine couche d’adhésif cyanoacrylate liquide le long de l’évidement de la fenêtre (figure 3M). Assurez-vous de ne pas mettre d’adhésif sur le tissu pancréatique.
22. À l’aide de ramasseurs à vide, soulevez la lamelle de 5 mm.
23. Placez soigneusement la lamelle à l’intérieur de l’évidement au centre du cadre de la fenêtre optique. Maintenir avec une légère pression, en laissant l’adhésif cyanoacrylate durcir (~25 s).
24. Séparez la lamelle des ramasseurs à vide à l’aide d’une pince.
25. Serrez les sutures au point de croix pour bien fixer le pancréas à la lamelle (Figure 3N,O). Remarque : Ne serrez pas trop le point de croix car cela peut endommager et ischémier le pancréas.
26. Coupez les extrémités de la suture.
27. Débranchez le ruban adhésif de la souris.
28. Éteignez le vaporisateur d’isoflurane.
29. Déplacez la souris dans une cage propre ou directement dans le microscope intravital.
30. Hébergez les animaux individuellement après une chirurgie de la fenêtre et surveillez-les jusqu’à leur rétablissement complet.
31. L’imagerie est ensuite réalisée sur un microscope multiphotonique à deux lasers, comme nous l’avons décrit précédemment. ^22,23,24 Pour les longues séances d’imagerie^, la souris est placée dans une chambre chauffée pour maintenir la température corporelle et reçoit des fluides de soutien conformément aux normes de l’IACUC.

5. Traitement par céruléine pour l’induction de la pancréatite

1. Pour étudier l’apparition de la pancréatite, traiter des souris saines avec de la céruléine après l’implantation du SWIP. Assurez-vous que les souris sont à jeun pendant 14 à 18 h et qu’elles reçoivent de l’eau à volonté avant l’administration de céruléine.
2. Injecter 50 μg/kg de céruléine dans 100 μL de 1x DPBS stérile par voie intrapéritonéale à 1 h d’intervalle pour un maximum de huit injections. Administrer un volume équivalent de 1x DPBS seul, injecté par voie intrapéritonéale, aux souris témoins.
3. Après l’imagerie, sacrifier les souris 24 h après la première injection par luxation cervicale selon les normes de l’IACUC.
4. Effectuer l’imagerie sur un microscope multiphotonique à deux lasers comme décrit précédemment^22,23,24. Pour les longues séances d’imagerie, placez la souris dans une chambre chauffée pour maintenir la température du corps et lui fournir des fluides de soutien conformément aux normes de l’IACUC.

Résultats

La figure 1, adaptée de Du et ^al.15, montre des images fixes d’un film IVI en accéléré du pancréas murin. Certains mouvements tissulaires peuvent être observés au cours de la période initiale de décantation (première heure d’imagerie, Figure 1A). Cependant, avec la poursuite de l’imagerie après cette période de stabilisation (>75 min), nous avons observé une augmentation de la stabilité latérale et axiale (

Discussion

Le protocole SWIP décrit ici fournit une méthode améliorée de stabilisation du tissu pancréatique en utilisant une technique de panier au point de croix. Les premières fenêtres d’imagerie abdominale (AIW) permettaient l’imagerie intravitale (IVI) des organes internes de l’abdomen, mais ne limitaient pas adéquatement le mouvement des tissus mous tels que le pancréas. En réponse, Park et al. ont mis au point une fenêtre d’imagerie du pancréas (PIW) qui intègre une étagère métallique horizontale et p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].