Ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas murino

Resumen

Presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanente estabilizada para la obtención de imágenes de resolución subcelular del páncreas murino, que permite realizar estudios seriados y longitudinales del páncreas sano y enfermo.

Resumen

La fisiología y la fisiopatología del páncreas son complejas. Las enfermedades del páncreas, como la pancreatitis y el adenocarcinoma de páncreas (PDAC, por sus siglas en inglés) tienen una alta morbilidad y mortalidad. La obtención de imágenes intravitales (IVI) es una técnica potente que permite obtener imágenes de alta resolución de tejidos tanto en estado sano como enfermo, lo que permite observar en tiempo real la dinámica celular. La IVI del páncreas murino presenta desafíos significativos debido a la naturaleza visceral profunda y distensible del órgano, lo que lo hace muy propenso a daños y artefactos de movimiento.

Aquí se describe el proceso de implantación de la Window Stabilizada para laobtención de imágenes intravitales de las Pancreas murinas (SWIP). El SWIP permite la IVI del páncreas murino en estados normales de salud, durante la transformación del páncreas sano a pancreatitis aguda inducida por ceruleína, y en estados malignos como los tumores pancreáticos. Junto con células marcadas genéticamente o la administración de colorantes fluorescentes, el SWIP permite la medición de la dinámica de una sola célula y subcelular (incluida la migración unicelular y colectiva), así como la obtención de imágenes en serie de la misma región de interés durante varios días.

La capacidad de capturar la migración de las células tumorales es de particular importancia, ya que la causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. La comprensión de la dinámica fisiológica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha y crucial para mejorar el pronóstico del paciente. En general, el SWIP proporciona una mejor estabilidad de la imagen y amplía la aplicación de IVI en el páncreas sano y las enfermedades malignas del páncreas.

Introducción

Las enfermedades pancreáticas benignas y malignas son potencialmente mortales, con lagunas considerables en la comprensión de su fisiopatología. La pancreatitis (inflamación del páncreas) es la tercera causa principal de ingresos y reingresos hospitalarios relacionados con enfermedades gastrointestinales en los EE. UU. y se asocia con una morbilidad, mortalidad^{y carga} socioeconómica sustanciales. Clasificado como la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer 2, el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) representa la mayoría de las neoplasias malignas de páncreas³ y presagia una baja tasa de supervivencia a 5 años de solo el 11 %². La principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes presentan enfermedad metastásica. Por lo tanto, la comprensión de la dinámica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha en el campo de la investigación del cáncer.

Los mecanismos que sustentan la inflamación y la cascada metastásica del páncreas son poco conocidos. Uno de los principales factores que contribuyen a esta brecha de conocimiento es la incapacidad de observar la dinámica celular pancreática in vivo. La observación directa de estas dinámicas celulares promete revelar objetivos críticos para aprovechar y mejorar el diagnóstico y el tratamiento de las personas con enfermedad pancreática.

La imagen intravital (IVI) es una técnica de microscopía que permite a los investigadores visualizar y estudiar los procesos biológicos en animales vivos en tiempo real. IVI permite la visualización directa y de alta resolución de la dinámica intracelular y microambiental in vivo y dentro del entorno nativo del proceso biológico en cuestión. Por lo tanto, IVI permite la observación in vivo de procesos sanos y patológicos.

Las modalidades contemporáneas de imágenes de cuerpo entero, como la resonancia magnética, la tomografía por emisión de positrones y la tomografía computarizada, ofrecen excelentes vistas de órganos completos y pueden revelar patologías, incluso antes de la aparición de los síntomas clínicos⁴. Sin embargo, no son capaces de lograr una resolución de una sola célula o revelar las primeras etapas de la enfermedad: pancreatitis o neoplasia maligna.

Investigaciones anteriores han utilizado IVI de resolución unicelular para observar enfermedades benignas y malignas de la piel^5,6, la mama⁷, el pulmón⁸, el hígado⁹, el cerebro 10 y los tumores pancreáticos 11^, lo que ha llevado a comprender los mecanismos de progresión de la enfermedad ¹². Sin embargo, el páncreas murino presenta obstáculos significativos para lograr la resolución de una sola célula mediante IVI, principalmente debido a su ubicación visceral profunda y su alta distensibilidad. Además, es un órgano ramificado y de distribución difusa dentro del mesenterio que se conecta con el bazo, el intestino delgado y el estómago, lo que dificulta su acceso. El tejido también es muy sensible al movimiento causado por el peristaltismo adyacente y la respiración. Minimizar el movimiento del páncreas es esencial para la microscopía de resolución unicelular, ya que los artefactos de movimiento de incluso unas pocas micras pueden desenfocar y distorsionar las imágenes, lo que^{hace imposible el} seguimiento de la dinámica de las células individuales.

Para la realización de la IVI se debe implantar quirúrgicamente una ventana de imagen abdominal (AIW) ^9,11. Para implantar quirúrgicamente el AIW, se sutura un marco de ventana de metal en la pared abdominal. Posteriormente, el órgano de interés se fija al marco mediante adhesivo de cianoacrilato. Si bien esto es suficiente para algunos órganos internos rígidos (p. ej., hígado, bazo, tumores rígidos), los intentos de obtener imágenes del páncreas murino sano se ven comprometidos por una estabilidad lateral y axial subóptima debido a la textura dócil del tejido y a la arquitectura compleja¹⁴. Para hacer frente a esta limitación, Park et ^al.14 desarrollaron una ventana de imagen diseñada específicamente para el páncreas sano. Esta ventana de imágenes de páncreas (PIW) minimiza la influencia del movimiento intestinal y la respiración al incorporar un estante metálico horizontal dentro del marco de la ventana, justo debajo del cubreobjetos, estabilizando el tejido y manteniendo su contacto con el cubreobjetos. Si bien el PIW ofrece una mayor estabilidad lateral, descubrimos que esta ventana aún muestra deriva axial y, además, evita la obtención de imágenes de tumores sólidos grandes debido al estrecho espacio entre el estante metálico y el cubreobjetos¹⁵.

Para hacer frente a estas limitaciones, desarrollamos el Window Stabilizado para laobtención de imágenes intravitales de las Páncreasmurinas (SWIP), una ventana de imagen implantable capaz de lograr una imagen estable a largo plazo tanto del páncreas sano como del enfermo (Figura 1)¹⁵. Aquí, proporcionamos un protocolo completo para el procedimiento quirúrgico utilizado para implantar el SWIP. Aunque el objetivo principal era estudiar los mecanismos dinámicos implicados en la metástasis, este método también puede utilizarse para explorar diversos aspectos de la biología y la patología del páncreas.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

1. Pasivación de ventanas

NOTA: La pasivación del acero inoxidable limpia el metal de contaminantes y crea una fina capa de óxido que aumenta en gran medida la biocompatibilidad del metal con los tejidos blandos, incluso más allá de la del titanio¹⁶.

1. Comience el proceso de pasivación lavando los marcos ópticos de las ventanas con una solución de detergente enzimáticamente activa al 1% (p/v).
2. Sumerja los marcos en una solución de hidróxido de sodio al 5% (p/v) a 70 °C durante 30 minutos dentro de un frasco de vidrio.
3. Saque los marcos y enjuáguelos con agua desionizada.
4. Sumerja los marcos en una solución de ácido cítrico al 7% (p/v) a 55 °C durante 10 minutos dentro de un frasco de vidrio nuevo.
5. Retire los marcos y enjuáguelos nuevamente con agua desionizada.
6. Repita el paso 1.2 y, finalmente, enjuague los marcos de las ventanas con agua desionizada por última vez.

2. Preparación para la implantación de tumores o cirugía de ventana

NOTA: Para los estudios de tumores pancreáticos, las células tumorales deben implantarse y dejarse crecer hasta convertirse en tumores manifiestos. Para visualizar las células tumorales in vivo, se recomienda utilizar células que han sido alteradas genéticamente para expresar proteínas fluorescentes como Dendra2. El uso de etiquetas de proteínas fluorescentes que sean brillantes mitigará los posibles problemas con la autofluorescencia tisular. Otras posibles proteínas fluorescentes, colorantes y modelos de ratones fluorescentes codificados genéticamente que pueden ser utilizados han sido discutidos en otro lugar^17,18. Para evitar la contaminación del campo operatorio, realice el procedimiento quirúrgico en una campana o cabina de flujo laminar y asegúrese de que se utilicen áreas distintas para la preparación, la cirugía y la recuperación.

1. Antes de la cirugía, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave y, si es necesario, use un esterilizador de perlas calientes para los procedimientos posteriores. Asegúrese de que la cirugía emplee una técnica de solo puntas.
2. Encienda la almohadilla quirúrgica calefactada y el esterilizador de perlas y espere a que alcance la temperatura de funcionamiento adecuada. La temperatura de la almohadilla térmica debe controlarse con un termómetro de superficie para evitar posibles quemaduras. Coloque un paño estéril sobre la almohadilla térmica si la temperatura no se puede controlar adecuadamente.
   NOTA: La temperatura corporal durante procedimientos cortos (≤20 min), como la implantación de tumores y ventanas, se ve mínimamente afectada mientras se usa una almohadilla quirúrgica caliente. Sin embargo, los períodos más largos de anestesia, como durante las imágenes de lapso de tiempo prolongado, requieren que el mouse se coloque en una cámara calentada para mantener la temperatura corporal.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano al 5% en una cámara de anestesia.
4. Paso crítico: Bajar la anestesia al 2% una vez que el ratón esté inconsciente. Controle cuidadosamente el nivel de anestesia y los signos vitales del ratón (p. ej., usando un oxímetro de pulso)¹⁹.
5. Coloque una pequeña gota de lubricante ocular en cada ojo del ratón para evitar que se seque la córnea.
6. Antes de la cirugía, aplique crema depilatoria generosamente en la parte superior izquierda del abdomen para eliminar el vello. Después de 20 segundos, use papel de seda humedecido para limpiar firmemente el vello y la crema depilatoria. Repita el proceso según sea necesario hasta que se elimine todo el vello del área quirúrgica.
7. Inyectar 10 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) diluido en 90 μL de PBS por vía subcutánea para asegurar la analgesia preoperatoria.

3. Implantación de tumores de páncreas

1. Preparar alícuotas de células tumorales a la concentración deseada (en función del tiempo de duplicación de las células tumorales). Coloque la suspensión celular en una jeringa de insulina y manténgala en hielo. Para seguir este protocolo, se utilizaron 10⁶ células tumorales KPC singénicas 20 suspendidas en un máximo de 50 μL de PBS, siguiendo el protocolo de inyección ortotópica adaptado de Erstad et^al.21
   NOTA: Esta línea celular inyectada a esta concentración producía rutinariamente tumores palpables o apropiadamente grandes a los 10-14 días. Los subclones de esta línea celular y de otras líneas celulares pancreáticas tendrían que ser evaluados para determinar las concentraciones y los plazos adecuados para producir tumores de tamaño adecuado).
2. Lávese las manos con jabón antiséptico.
3. Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
4. Transfiera el ratón a la campana quirúrgica estéril y colóquelo en una posición de decúbito lateral derecho parcial.
5. Asegure las extremidades con cinta adhesiva.
   NOTA: El uso adecuado de los instrumentos es importante durante todo el procedimiento. En la Figura 2A-C se muestran ejemplos de cómo sujetar fórceps, tijeras Castroviejo y la herramienta de recogida de vacío.
6. Esterilizar el abdomen con un antiséptico (Figura 2D).
7. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado realizando una prueba de pellizco en los dedos de los pies.
8. Realizar una incisión subcostal izquierda de 10-15 mm en la piel con pinzas y tijeras Castroviejo (Figura 2E).
9. Controle la hemostasia con hisopos de algodón o un bolígrafo de cauterización cuando/donde se considere necesario.
10. Divida cuidadosamente el músculo subyacente con fórceps y tijeras Castroviejo para introducir el peritoneo (Figura 2F).
11. Con hisopos de algodón estériles, externalice el páncreas y el bazo de forma atraumática.
12. Extienda el páncreas para que no queden pliegues (Figura 2G).
13. Identificar el sitio deseado para la inyección del tumor en el cuerpo o la cola del páncreas (lejos de los vasos sanguíneos).
14. Paso crítico: Después de colocar cuidadosamente el páncreas, use fórceps para proporcionar tensión al tejido e inserte la punta de la jeringa de insulina, con el bisel hacia arriba, en el sitio deseado del páncreas a una profundidad de 4-5 mm (Figura 2H).
15. Inyecte lentamente la solución de células tumorales. Busque una pequeña burbuja que confirme que la inyección se ha realizado correctamente (Figura 2I).
16. Regrese con cuidado el páncreas al abdomen sin alterar la burbuja de inyección de células tumorales (Figura 2J).
17. Usando suturas absorbibles de polidioxanona 5-0, cierre primero la capa muscular y luego la piel con suturas interrumpidas (Figura 2K-N).
18. Cubra la incisión con pegamento de cianoacrilato (Figura 2O), luego regrese el ratón a una jaula limpia debajo de una lámpara de calefacción para su recuperación. Administre antibióticos en el agua potable para prevenir infecciones. Monitoree a los ratones y permita que se recuperen por completo de la cirugía.
    NOTA: Los antibióticos se administran según lo requerido por el protocolo de la IACUC. Todos los animales se alojan individualmente.
19. Deje que el tumor se desarrolle durante 10 a 14 días hasta que sea palpable a través de la pared abdominal.

4. Cirugía de ventana de páncreas

1. Cuando los animales estén listos para la toma de imágenes, comience la cirugía de implantación de ventana. Para empezar, lávese las manos con jabón antiséptico.
2. Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
3. En el soporte quirúrgico calefactado, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho para exponer el abdomen izquierdo.
4. Ancla las extremidades delanteras y traseras del ratón a la etapa quirúrgica calentada craneal y caudalmente con cinta de papel. Asegúrese de que el bazo (debajo de la piel) sea visible dentro del campo quirúrgico (Figura 3A).
5. Para mantener la esterilidad, desempaque todos los instrumentos quirúrgicos en la campana.
6. Desinfecte el sitio quirúrgico frotando la piel del ratón con una aplicación generosa de antiséptico.
7. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado realizando una prueba de pellizco en los dedos de los pies.
8. Paso crítico: Levantar la piel del cuadrante superior izquierdo del abdomen con pinzas y hacer una incisión circular de ~10 mm en la piel y la musculatura con unas tijeras Castroviejo (Figura 3B,C).
9. Controle el sangrado y mantenga la hemostasia con hisopos de algodón o la pluma de cauterización, cuando sea necesario.
10. Localice el páncreas, que está unido al bazo, e identifique la dirección en la que se encuentra el páncreas dentro de la incisión para decidir dónde se debe colocar el punto de cruz de soporte.
11. Con una sutura de seda 5-0, coloque el primer punto en el lugar deseado de la capa muscular. Amarre este extremo con 3-5 nudos. (Figura 3D,E)
12. Continúe suturando directamente a través de la incisión. Corta y deja una cola de ~5 cm (Figura 3F).
13. Repita los pasos 4.11 y 4.12 perpendicularmente al primer punto (Figura 3G, H).
14. Paso crítico: Levante suavemente y coloque el páncreas sobre el punto de cruz (Figura 3I, J). Tenga cuidado de no dañar el páncreas durante la manipulación.
15. Paso crítico: Usando la sutura de seda 5-0, realice una puntada de cuerda de bolsa a ~ 1 mm del orificio, circunferencialmente, entrelazando la piel y la capa muscular (Figura 3K).
16. Coloque el marco de la ventana de modo que los bordes de la incisión circular queden asentados dentro de la ranura de la ventana (Figura 3L).
17. Cierre la ventana implantada atando firmemente la seda 5-0.
18. Cargue 100 μL de adhesivo líquido de cianoacrilato en la jeringa de 1 mL.
19. Seque el tejido aplicando un delicado flujo de aire comprimido durante ~10 s.
20. Sujete el marco de la ventana por su borde exterior con pinzas y levántelo suavemente para asegurar la separación del páncreas de la superficie inferior del marco de la ventana.
21. Paso crítico: Dispense una capa delgada de adhesivo líquido de cianoacrilato a lo largo del hueco de la ventana (Figura 3M). Asegúrese de que el adhesivo no entre en contacto con el tejido del páncreas.
22. Con los recogedores de vacío, levante el cubreobjetos de 5 mm.
23. Coloque con cuidado el cubreobjetos dentro del hueco en el centro del marco de la ventana óptica. Sosténgalo con una ligera presión, permitiendo que el adhesivo de cianoacrilato se asiente (~25 s).
24. Separe el cubreobjetos de los recogedores de vacío con unas pinzas.
25. Apriete las suturas de punto de cruz para asegurar el páncreas cómodamente al cubreobjetos (Figura 3N, O). Nota: No apriete demasiado el punto de cruz, ya que puede causar daños e isquemia en el páncreas.
26. Corta los extremos de la sutura.
27. Quita la cinta del ratón.
28. Apague el vaporizador de isoflurano.
29. Reubique el ratón en una jaula limpia o directamente en el microscopio intravital.
30. Aloje a los animales individualmente después de la cirugía de ventana y vigílelos hasta que se recuperen por completo.
31. A continuación, la obtención de imágenes se lleva a cabo en un microscopio multifotónico de dos láseres, como hemos descrito anteriormente.22,23,24 Para largas sesiones de obtención de imágenes^, el ratón se coloca en una cámara calentada para mantener la temperatura corporal y se le proporcionan fluidos de apoyo según las normas de la IACUC^.

5. Tratamiento con ceruleína para la inducción de pancreatitis

1. Para investigar la aparición de la pancreatitis, se debe tratar a ratones sanos con ceruleína después de la implantación del SWIP. Asegúrese de que los ratones estén en ayunas durante 14-18 h y se les administre agua ad libitum antes de la administración de cerulína.
2. Inyectar 50 μg/kg de ceruleína en 100 μL de DPBS 1x estéril por vía intraperitoneal a intervalos de 1 h durante un máximo de ocho inyecciones. Administrar un volumen equivalente de 1x DPBS solo, inyectado por vía intraperitoneal, a los ratones de control.
3. Después de las imágenes, sacrifique a los ratones 24 horas después de la primera inyección por luxación cervical según los estándares de la IACUC.
4. Realice imágenes en un microscopio multifotónico de dos láseres como se describió anteriormente^22,23,24. Para sesiones de imágenes prolongadas, coloque el mouse en una cámara calentada para mantener la temperatura corporal y proporcionarle líquidos de apoyo según los estándares de IACUC.

Resultados

La Figura 1, adaptada de Du et ^al.15, muestra imágenes fijas de una película IVI de lapso de tiempo del páncreas murino. Se puede observar algún movimiento tisular dentro del período de asentamiento inicial (primera hora de la imagen, Figura 1A). Sin embargo, con la continuación de las imágenes después de este período de asentamiento (>75 min), observamos un aumento de la estabilidad lateral y axial (Figura 1...

Discusión

El protocolo SWIP descrito aquí proporciona un método mejorado de estabilización del tejido pancreático mediante la utilización de una técnica de canasta de punto de cruz. Las primeras ventanas de imágenes abdominales (AIW, por sus siglas en inglés) permitieron la obtención de imágenes intravitales (IVI, por sus siglas en inglés) de los órganos internos del abdomen, pero no limitaron adecuadamente el movimiento de los tejidos blandos, como el páncreas. En respuesta, Park et al. desarrollaron una ventana de i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].