Ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas murino

Resumen

Presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanente estabilizada para la obtención de imágenes de resolución subcelular del páncreas murino, que permite realizar estudios seriados y longitudinales del páncreas sano y enfermo.

Resumen

La fisiología y la fisiopatología del páncreas son complejas. Las enfermedades del páncreas, como la pancreatitis y el adenocarcinoma de páncreas (PDAC, por sus siglas en inglés) tienen una alta morbilidad y mortalidad. La obtención de imágenes intravitales (IVI) es una técnica potente que permite obtener imágenes de alta resolución de tejidos tanto en estado sano como enfermo, lo que permite observar en tiempo real la dinámica celular. La IVI del páncreas murino presenta desafíos significativos debido a la naturaleza visceral profunda y distensible del órgano, lo que lo hace muy propenso a daños y artefactos de movimiento.

Aquí se describe el proceso de implantación de la Window Stabilizada para laobtención de imágenes intravitales de las Pancreas murinas (SWIP). El SWIP permite la IVI del páncreas murino en estados normales de salud, durante la transformación del páncreas sano a pancreatitis aguda inducida por ceruleína, y en estados malignos como los tumores pancreáticos. Junto con células marcadas genéticamente o la administración de colorantes fluorescentes, el SWIP permite la medición de la dinámica de una sola célula y subcelular (incluida la migración unicelular y colectiva), así como la obtención de imágenes en serie de la misma región de interés durante varios días.

La capacidad de capturar la migración de las células tumorales es de particular importancia, ya que la causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en el PDAC es la abrumadora carga metastásica. La comprensión de la dinámica fisiológica de la metástasis en el PDAC es una necesidad crítica no satisfecha y crucial para mejorar el pronóstico del paciente. En general, el SWIP proporciona una mejor estabilidad de la imagen y amplía la aplicación de IVI en el páncreas sano y las enfermedades malignas del páncreas.

Introducción

Las enfermedades pancreáticas benignas y malignas son potencialmente mortales, con lagunas considerables en la comprensión de su fisiopatología. La pancreatitis (inflamación del páncreas) es la tercera causa principal de ingresos y reingresos hospitalarios relacionados con enfermedades gastrointestinales en los EE. UU. y se asocia con una morbilidad, mortalidad^{y carga} socioeconómica sustanciales. Clasificado como la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer 2, el adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) representa la mayoría de las neoplasias malignas de páncreas³ y presagia una baja tasa de supervivenc....

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

1. Pasivación de ventanas

NOTA: La pasivación del acero inoxidable limpia el metal de contaminantes y crea una fina capa de óxido que aumenta en gran medida la biocompatibilidad del metal con los tejidos blandos, incluso más allá de la del titanio¹⁶.

1. Comience el proceso de pasivación ....

Discusión

El protocolo SWIP descrito aquí proporciona un método mejorado de estabilización del tejido pancreático mediante la utilización de una técnica de canasta de punto de cruz. Las primeras ventanas de imágenes abdominales (AIW, por sus siglas en inglés) permitieron la obtención de imágenes intravitales (IVI, por sus siglas en inglés) de los órganos internos del abdomen, pero no limitaron adecuadamente el movimiento de los tejidos blandos, como el páncreas. En respuesta, Park et al. desarrollaron una ventana de i.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].