Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Resumo

Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.

Resumo

A fisiologia e fisiopatologia do pâncreas são complexas. Doenças do pâncreas, como pancreatite e adenocarcinoma pancreático (ADP), apresentam alta morbidade e mortalidade. A imagem intravital (IVI) é uma técnica poderosa que permite a obtenção de imagens de alta resolução de tecidos em estados saudáveis e doentes, permitindo a observação em tempo real da dinâmica celular. A IVI do pâncreas murino apresenta desafios significativos devido à natureza visceral profunda e complacente do órgão, o que o torna altamente propenso a danos e artefatos de movimento.

Descreve-se aqui o processo de implantação do Stabilizado Window para Intravital imageamento do pâncreas Pmurino (SWIP). O SWIP permite IVI do pâncreas murino em estados normais saudáveis, durante a transformação do pâncreas saudável para pancreatite aguda induzida por ceruleína, e em estados malignos, como tumores pancreáticos. Em conjunto com células geneticamente marcadas ou a administração de corantes fluorescentes, o SWIP permite a medição da dinâmica de célula única e subcelular (incluindo migração de célula única e coletiva), bem como imagens seriadas da mesma região de interesse durante vários dias.

A capacidade de capturar a migração de células tumorais é de particular importância, pois a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a carga metastática esmagadora. A compreensão da dinâmica fisiológica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida e crucial para melhorar o prognóstico dos pacientes. Em geral, o SWIP fornece melhor estabilidade de imagem e expande a aplicação de IVI no pâncreas saudável e doenças malignas do pâncreas.

Introdução

As doenças pancreáticas benignas e malignas são potencialmente fatais, com lacunas consideráveis no entendimento de sua fisiopatologia. A pancreatite, inflamação do pâncreas, é a terceira maior causa de internações e readmissões hospitalares relacionadas a doenças gastrointestinais nos EUA e está associada a substancial morbidade, mortalidade e carga socioeconômica¹. Classificado como a terceira causa de morte relacionada ao^câncer2, o adenocarcinoma ductal do pâncreas (ADP) é responsável pela maioria das neoplasias malignas pancreáticas3 e prenuncia uma baixa taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 11%². A principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a sobrecarga metastática. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta doença metastática. Portanto, compreender a dinâmica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida no campo da pesquisa em câncer.

Os mecanismos subjacentes à inflamação e à cascata metastática do pâncreas são pouco compreendidos. Um dos principais contribuintes para essa lacuna no conhecimento é a incapacidade de observar a dinâmica celular pancreática in vivo. A observação direta dessas dinâmicas celulares promete desvendar alvos críticos para alavancar e melhorar o diagnóstico e o tratamento de pessoas com doença pancreática.

A imagem intravital (IVI) é uma técnica de microscopia que permite aos pesquisadores visualizar e estudar processos biológicos em animais vivos em tempo real. O IVI permite a visualização direta e de alta resolução da dinâmica intracelular e microambiental in vivo e dentro do ambiente nativo do processo biológico em questão. Portanto, a IVI permite a observação in vivo de processos patológicos e saudáveis.

As modalidades contemporâneas de imagem de corpo inteiro, como RM, PET e TC, oferecem excelentes visões de órgãos inteiros e podem revelar patologias, mesmo antes do início dos sintomas^clínicos4. Eles são incapazes, no entanto, de atingir resolução de célula única ou revelar os estágios iniciais da doença-pancreatite ou malignidade.

Pesquisas anteriores utilizaram IVI de resolução unicelular para observar doenças benignas e malignas de tumores cutâneos^5,6, mama⁷, pulmão⁸, fígado⁹, cérebro 10 e^pâncreas11, levando a insights sobre mecanismos de progressão da doença¹². No entanto, o pâncreas murino apresenta obstáculos significativos para alcançar a resolução unicelular usando IVI, principalmente devido à sua localização visceral profunda e alta complacência. Além disso, é um órgão ramificado e difusamente distribuído dentro do mesentério que se conecta ao baço, intestino delgado e estômago, dificultando o acesso. O tecido também é altamente sensível ao movimento causado pelo peristaltismo adjacente e pela respiração. A minimização do movimento do pâncreas é essencial para a microscopia de resolução unicelular, pois artefatos de movimento de até alguns mícrons podem borrar e distorcer as imagens, impossibilitando o rastreamento da dinâmica de células individuais¹³.

Para a realização da IVI, uma janela de imagem abdominal (AIW) deve ser implantada cirurgicamente ^9,11. Para implantar o AIW cirurgicamente, uma moldura de janela metálica é suturada na parede abdominal. Em seguida, o órgão de interesse é fixado ao quadro com adesivo de cianoacrilato. Embora isso seja suficiente para alguns órgãos internos rígidos (por exemplo, fígado, baço, tumores rígidos), as tentativas de obtenção de imagens do pâncreas murino saudável são comprometidas pela estabilidade lateral e axial subótima, devido à textura compatível e à arquitetura complexa do tecido¹⁴. Para resolver essa limitação, Park et ^al.14 desenvolveram uma janela de imagem projetada especificamente para o pâncreas saudável. Esta Janela de Imagem do Pâncreas (PIW) minimiza a influência do movimento intestinal e da respiração, incorporando uma prateleira metálica horizontal dentro da moldura da janela, logo abaixo da lamínula, estabilizando o tecido e mantendo seu contato com o vidro da tampa. Embora o PIP ofereça maior estabilidade lateral, observamos que essa janela ainda demonstra desvio axial e, adicionalmente, impede a obtenção de imagens de grandes tumores sólidos devido ao estreito espaço entre a plataforma metálica e o lamínulo¹⁵.

Para resolver essas limitações, desenvolvemos o Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), uma janela de imagem implantável capaz de obter imagens estáveis a longo prazo do pâncreas saudável e doente (Figura 1)¹⁵. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para o procedimento cirúrgico usado para implantar o SWIP. Embora o objetivo primário tenha sido estudar os mecanismos dinâmicos envolvidos na metástase, este método também pode ser utilizado para explorar vários aspectos da biologia e patologia do pâncreas.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein (IACUC).

1. Passivação de janelas

NOTA: A passivação do aço inoxidável limpa o metal de contaminantes e cria uma fina camada de óxido que aumenta muito a biocompatibilidade do metal com os tecidos moles, mesmo além do titânio¹⁶.

1. Inicie o processo de passivação lavando as esquadrias ópticas com uma solução de detergente enzimaticamente ativa a 1% (p/v).
2. Submergir as armações em uma solução de hidróxido de sódio a 5% (p/v) a 70 °C por 30 min dentro de um frasco de vidro.
3. Retire as armações e enxágue-as com água deionizada.
4. Mergulhe as armações em uma solução de ácido cítrico a 7% (p/v) a 55 °C por 10 min dentro de um novo frasco de vidro.
5. Retire as armações e enxágue-as com água deionizada novamente.
6. Repita o passo 1.2 e, finalmente, lave as esquadrias das janelas com água deionizada uma última vez.

2. Preparo para implante de tumor ou cirurgia de janela

NOTA: Para estudos de tumores pancreáticos, as células tumorais devem ser implantadas e permitir que cresçam em tumores evidentes. Para visualizar as células tumorais in vivo, recomenda-se o uso de células geneticamente alteradas para expressar proteínas fluorescentes, como a Dendra2. O uso de rótulos de proteínas fluorescentes brilhantes atenuará possíveis problemas com a autofluorescência tecidual. Outras potenciais proteínas fluorescentes, corantes e modelos de camundongos fluorescentes codificados geneticamente que podem ser utilizados têm sido discutidos em outros estudos^17,18. Para evitar a contaminação do campo operatório, realize o procedimento cirúrgico em uma capela ou gabinete de fluxo laminar e garanta que áreas distintas sejam usadas para preparação, cirurgia e recuperação.

1. Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave e, se necessário, usar um esterilizador de esferas quentes para procedimentos subsequentes. Certifique-se de que a cirurgia emprega uma técnica apenas de pontas.
2. Ligue a almofada cirúrgica aquecida e o esterilizador de contas e aguarde que atinja a temperatura de operação adequada. A temperatura da almofada de aquecimento deve ser monitorada com um termômetro de superfície para evitar possíveis queimaduras. Coloque um pano estéril sobre a almofada de aquecimento se a temperatura não puder ser adequadamente controlada.
   NOTA: A temperatura corporal durante procedimentos curtos (≤20 min), como tumor e implante de janela, é minimamente afetada durante o uso de um coxim cirúrgico aquecido. No entanto, períodos mais longos de anestesia, como durante imagens de lapso de tempo prolongado, exigem que o mouse seja colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal.
3. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em câmara de anestesia.
4. Passo crítico: Abaixe a anestesia para 2% quando o rato estiver inconsciente. Monitorar cuidadosamente o nível de anestesia e os sinais vitais do mouse (por exemplo, usando um oxímetro de pulso)¹⁹.
5. Coloque uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho do rato para evitar o ressecamento da córnea.
6. Antes da cirurgia, aplique creme depilatório generosamente no abdome superior esquerdo para remover os pelos. Após 20 s, use papel higiênico umedecido para limpar firmemente o cabelo e creme depilatório. Repita o processo conforme necessário até que todos os cabelos sejam removidos da área cirúrgica.
7. Injetar 10 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) diluídos em 90 μL de PBS por via subcutânea para garantir analgesia pré-operatória.

3. Implante de tumor de pâncreas

1. Preparar alíquotas de células tumorais na concentração desejada (com base no tempo de duplicação de células tumorais). Coloque a suspensão celular em uma seringa de insulina e mantenha-a no gelo. Para seguir esse protocolo, utilizar^{10 6} células tumorais KPC singênicas 20 suspensas em no máximo 50 μL de PBS, seguindo o protocolo de injeção ortotópica adaptado de Erstad et^al.21
   NOTA: Esta linhagem celular injetada nesta concentração produziu rotineiramente tumores palpáveis ou apropriadamente grandes por 10-14 dias. Subclones dessa linhagem celular e de outras linhagens de células pancreáticas precisariam ser avaliados quanto a concentrações e prazos apropriados para produzir tumores de tamanho adequado).
2. Lave as mãos usando sabão antisséptico.
3. Antes de cada nova cirurgia, coloque novas luvas estéreis.
4. Transfira o mouse para o capuz cirúrgico estéril e coloque-o em decúbito lateral parcial direito.
5. Fixe os membros com fita adesiva de papel.
   NOTA: O uso adequado dos instrumentos é importante durante todo o procedimento. Exemplos de como segurar pinças, tesouras Castroviejo e a ferramenta de captação a vácuo são mostrados na Figura 2A-C.
6. Esterilizar o abdome com antisséptico (Figura 2D).
7. Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.
8. Realizar incisão subcostal esquerda de 10 a 15 mm na pele com pinça e tesoura de Castroviejo (Figura 2E).
9. Controle a hemostasia com cotonetes ou cautério quando/quando necessário.
10. Divida cuidadosamente o músculo subjacente com pinça e tesoura de Castroviejo para entrar no peritônio (Figura 2F).
11. Usando cotonetes estéreis, exteriorizar atraumaticamente o pâncreas e o baço.
12. Jogue o pâncreas para fora para que não haja dobras (Figura 2G).
13. Identificar o local de injeção do tumor desejado no corpo ou cauda do pâncreas (longe dos vasos sanguíneos).
14. Passo crítico: Após o posicionamento cuidadoso do pâncreas, utilizar pinça para dar tensão ao tecido e inserir a ponta da seringa de insulina, com o bisel voltado para cima, no local desejado do pâncreas a uma profundidade de 4-5 mm (Figura 2H).
15. Injete lentamente a solução de células tumorais. Procure uma pequena bolha que confirme o sucesso da injeção (Figura 2I).
16. Retornar cuidadosamente o pâncreas para o abdome sem perturbar a bolha de injeção de células tumorais (Figura 2J).
17. Com fio absorvível de polidioxanona 5-0, fechar-se primeiro a camada muscular e, em seguida, a pele com pontos interrompidos (Figura 2K-N).
18. Cubra a incisão com cola de cianoacrilato (Figura 2O) e, em seguida, devolva o rato a uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento para recuperação. Administrar antibióticos em água potável para prevenir a infecção. Monitore os ratos e permita que eles se recuperem completamente da cirurgia.
    NOTA: Os antibióticos são administrados conforme exigido pelo protocolo da IACUC. Todos os animais são alojados individualmente.
19. Deixe o tumor se desenvolver por 10-14 dias até que seja palpável através da parede abdominal.

4. Cirurgia da janela do pâncreas

1. Quando os animais estiverem prontos para exames de imagem, inicie a cirurgia de implante de janela. Para começar, lave as mãos com sabão antisséptico.
2. Antes de cada nova cirurgia, coloque luvas estéreis frescas.
3. No banco cirúrgico aquecido, colocar o mouse em decúbito lateral direito para expor o abdome esquerdo.
4. Ancorar os membros anteriores e posteriores do mouse ao estágio cirúrgico aquecido cranial e caudalmente usando fita adesiva de papel. Verifique se o baço (abaixo da pele) é visível dentro do campo cirúrgico (Figura 3A).
5. Para manter a esterilidade, desembale todos os instrumentos cirúrgicos no capô.
6. Desinfete o local cirúrgico esfregando a pele do rato com uma generosa aplicação de antisséptico.
7. Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.
8. Passo crítico: Levantar a pele do quadrante superior esquerdo do abdome com pinça e fazer uma incisão circular de ~10 mm na pele e musculatura com tesoura de Castroviejo (Figura 3B,C).
9. Controle o sangramento e mantenha a hemostasia usando cotonetes ou cautério, quando necessário.
10. Localize o pâncreas, que está preso ao baço, e identifique a direção em que o pâncreas está deitado dentro da incisão para decidir onde o ponto cruzado de suporte deve ser colocado.
11. Usando sutura de seda 5-0, coloque o primeiro ponto no local desejado na camada muscular. Empate este final com 3-5 nós. (Figura 3D,E)
12. Continue a costurar diretamente através da incisão. Corte e deixe uma cauda de ~5 cm (Figura 3F).
13. Repetir os passos 4.11 e 4.12 perpendicularmente ao primeiro ponto (Figura 3G,H).
14. Passo crítico: Levante e posicione suavemente o pâncreas sobre o ponto cruzado (Figura 3I,J). Tome cuidado para não danificar o pâncreas durante a manipulação.
15. Passo crítico: Com fio de seda 5-0, realizar um ponto bolsa-corda a ~1 mm do orifício, circunferencialmente, entrelaçando a pele e a camada muscular (Figura 3K).
16. Posicione a moldura da janela de modo que as bordas da incisão circular fiquem assentadas dentro do sulco da janela (Figura 3L).
17. Aperte a janela implantada amarrando firmemente a seda 5-0.
18. Carregar 100 μL de adesivo líquido de cianoacrilato na seringa de 1 mL.
19. Seque o tecido aplicando um fluxo delicado de ar comprimido por ~10 s.
20. Aperte a moldura da janela por sua borda externa com pinça e levante-a suavemente para garantir a separação do pâncreas da superfície inferior da moldura da janela.
21. Etapa crítica: Dispensar uma fina camada de adesivo líquido de cianoacrilato ao longo do recesso da janela (Figura 3M). Certifique-se de não obter nenhum do adesivo no tecido do pâncreas.
22. Usando captadores a vácuo, levante a tampa de 5 mm.
23. Coloque cuidadosamente a tampa dentro do recesso no centro da moldura da janela óptica. Segure com leve pressão, permitindo que o adesivo de cianoacrilato se ajuste (~25 s).
24. Separe a tampa dos captadores a vácuo usando pinças.
25. Apertar as suturas de ponto cruzado para fixar o pâncreas confortavelmente à lamínula (Figura 3N,O). Nota: Não aperte demais o ponto cruz, pois pode causar danos e isquemia ao pâncreas.
26. Corte as extremidades da sutura.
27. Retire a fita do mouse.
28. Desligue o vaporizador de isoflurano.
29. Deslocar o rato para uma gaiola limpa ou diretamente para o microscópio intravital.
30. Alojar os animais individualmente após a cirurgia de janela e monitorá-los até a recuperação completa.
31. As imagens são então realizadas em microscópio multifóton bilaser, como descrito anteriormente ^22,23,24 Para longas sessões de imagem^, o camundongo é colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecido com fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.

5. Tratamento com Ceruleína para a indução de pancreatite

1. Para investigar o início da pancreatite, tratar camundongos saudáveis com cerúleina após a implantação do SWIP. Certifique-se de que os ratos estão em jejum durante 14-18 h e recebem água ad libitum antes da administração de ceruleína.
2. Injetar 50 μg/kg de ceruleína em 100 μL de 1x DPBS estéril por via intraperitoneal a intervalos de 1 h para até oito injeções. Administrar um volume equivalente de 1x DPBS isoladamente, injetado intraperitonealmente, aos camundongos controle.
3. Após a aquisição de imagem, sacrificar os camundongos 24 h após a primeira injeção por deslocamento cervical de acordo com os padrões da IACUC.
4. Realizar exames de imagem em microscópio multifóton bilaser conforme descrito anteriormente^22,23,24. Para longas sessões de imagem, coloque o mouse em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecer-lhe fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.

Resultados

A Figura 1, adaptada de Du et ^al.15, mostra imagens de um filme de IVI com lapso de tempo do pâncreas murino. Alguma movimentação tecidual pode ser observada dentro do período inicial de sedimentação (primeira hora de exame, Figura 1A). No entanto, com a continuidade dos exames de imagem após esse período de sedimentação (>75 min), observamos um aumento da estabilidade lateral e axial (Figura 1B). A...

Discussão

O protocolo SWIP descrito aqui fornece um método aprimorado de estabilização do tecido pancreático utilizando uma técnica de cesto de ponto cruzado. As janelas de imagem abdominais precoces (AIWs) permitiram imagens intravitais (IVI) de órgãos internos do abdome, mas não limitaram adequadamente o movimento de tecidos moles, como o pâncreas. Em resposta, Park e col. desenvolveram uma janela de imagem do pâncreas (PIW) que incorpora uma prateleira metálica horizontal e permite uma melhor estabilização do tecid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].