マウス膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ

要約

マウス膵臓の細胞内分解能イメージングのための安定化された留置光学窓の外科的移植のプロトコルを提示し、健康な膵臓と病気の膵臓の連続的および縦断的研究を可能にします。

要約

膵臓の生理学と病態生理学は複雑です。膵炎や膵臓腺癌(PDAC)などの膵臓の疾患は、罹患率と死亡率が高い。生体内イメージング(IVI)は、健康な状態と病気の状態の両方の組織の高解像度イメージングを可能にする強力な技術であり、細胞動態のリアルタイム観察を可能にします。マウス膵臓のIVIは、臓器の深い内臓とコンプライアンスの性質により、損傷や運動アーチファクトが非常に起こりやすいため、重大な課題を提示します。

ここで説明するのは、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージングのためのStabilized Wインドウの移植プロセスです。SWIPは、正常な健康な状態、健康な膵臓からセルレインによって誘発される急性膵炎への転換中、および膵臓腫瘍などの悪性状態におけるマウス膵臓のIVIを可能にします。SWIPは、遺伝子標識細胞または蛍光色素の投与と組み合わせて、単一細胞および細胞内動態(単一細胞および集団移動を含む)の測定、および数日間にわたる同じ関心領域の連続イメージングを可能にします。

PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は圧倒的な転移性負担であるため、腫瘍細胞の移動を捕捉する能力は特に重要です。PDACにおける転移の生理学的動態を理解することは、満たされていない重要なニーズであり、患者の予後を改善するために重要です。全体として、SWIPはイメージングの安定性を向上させ、健康な膵臓および悪性膵臓疾患におけるIVIの適用を拡大します。

概要

良性および悪性の膵臓疾患は生命を脅かす可能性があり、その病態生理学の理解にはかなりのギャップがあります。膵炎(膵臓の炎症)は、米国における消化器疾患関連の入院および再入院の第3大原因であり、かなりの罹患率、死亡率、および社会経済的負担に関連しています¹。膵管腺がん(PDAC)は、がん関連死因の第3位2にランク^{されており、膵}臓悪性腫瘍の大半を占め^ており3 、5年生存率はわずか11%²と低いことを示しています。PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は、圧倒的な転移性負担です。残念ながら、ほとんどの患者は転移性疾患を呈します。したがって、PDACにおける転移の動態を理解することは、がん研究の分野における重要なアンメットニーズです。

炎症と膵臓の転移カスケードを支えるメカニズムは十分に理解されていません。この知識のギャップの主な原因は、 in vivoで膵臓の細胞動態を観察できないことです。これらの細胞動態を直接観察することで、膵臓疾患患者の診断と治療を活用し、改善するための重要な標的を明らかにすることが期待されます。

生体内イメージング(IVI)は、研究者が生きている動物の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化して研究....

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバートアインシュタイン医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前承認を含む、脊椎動物の使用に関するガイドラインと規制に従って実行されています。

1.窓の不動態化

注:ステンレス鋼の不動態化処理は、金属の汚染物質を洗浄し、薄い酸化物層を形成して、チタン¹⁶の生体適合性を超えて、軟部組織との金属の生体適合性を大幅に向上させます。

1. 光学窓枠を1%(w / v)の酵素活性洗剤溶液で洗浄することにより、不動態化プロセスを開始します。
2. フレームをガラス瓶内の5%(w / v)水酸化ナトリウム溶液に70°Cで30分間浸します。
3. フレームを取り出し、脱イオン水ですすいでください。
4. フレームを7%(w/v)クエン酸溶液、55°C、10分間、新しいガラス瓶に浸します。
5. フレームを取り外し、脱イオン水で再度すすいでください。
6. 手順1.2を繰り返し、最後にもう一度窓枠を脱イオン水ですすいでください。

2.腫瘍移植または窓手術の準備

ディスカッション

ここで説明するSWIPプロトコルは、クロスステッチバスケット技術を利用して、膵臓組織を安定化するための改良された方法を提供します。初期の腹部画像窓(AIW)は、腹部の内臓の生体内画像(IVI)を可能にしたが、膵臓などの軟部組織の動きを適切に制限していなかった。これに対応して、Parkらは、水平の金属棚を組み込んで、ガラスカバーガラスとの接触を維持しながら膵臓組織の安定性を?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].