A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.

Abstract

הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלבלב מורכבות. מחלות הלבלב, כגון דלקת הלבלב ואדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) הן בעלות תחלואה ותמותה גבוהות. הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות הן במצב בריא והן במצב חולה, ומאפשרת תצפית בזמן אמת על הדינמיקה של התא. IVI של הלבלב המורין מציב אתגרים משמעותיים בשל האופי הקרבי העמוק והתואם של האיבר, מה שהופך אותו למועד מאוד לנזק ותנועה.

מתואר כאן תהליך ההשתלה של Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). SWIP מאפשר IVI של הלבלב murine במצבים בריאים נורמליים, במהלך המעבר מהלבלב הבריא לדלקת לבלב חריפה הנגרמת על ידי cerulein, ובמצבים ממאירים כגון גידולים בלבלב. בשילוב עם תאים המסומנים גנטית או מתן צבעים פלואורסצנטיים, SWIP מאפשר מדידה של דינמיקה של תא בודד ותת-תאי (כולל הגירה חד-תאית וקולקטיבית) כמו גם הדמיה סדרתית של אותו אזור עניין במשך מספר ימים.

היכולת ללכוד נדידת תאי גידול היא בעלת חשיבות מיוחדת מכיוון שהגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן ב- PDAC הוא הנטל הגרורתי העצום. הבנת הדינמיקה הפיזיולוגית של גרורות ב- PDAC היא צורך קריטי שלא נענה וחיוני לשיפור הפרוגנוזה של המטופל. בסך הכל, SWIP מספק יציבות הדמיה משופרת ומרחיב את היישום של IVI בלבלב בריא ומחלות לבלב ממאירות.

Introduction

מחלות לבלב שפירות וממאירות עלולות לסכן חיים, עם פערים ניכרים בהבנת הפתופיזיולוגיה שלהן. דלקת הלבלב - דלקת בלבלב - היא הגורם השלישי בחשיבותו לאשפוזים ואשפוזים חוזרים הקשורים למחלות במערכת העיכול בארה"ב והיא קשורה לתחלואה משמעותית, תמותה ונטל סוציו-אקונומי1. מדורג כגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן2, אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) מהווה את רוב הממאירויות בלבלב3 ומבשר על שיעור הישרדות גרוע של 5 שנים של 11% בלבד 2. הגורם המוביל לתמותה מסרטן ב-PDAC הוא עומס גרורתי עצום. למרבה הצער, רוב החולים נוכחים עם מחלה גרורתית. לכן, הבנת הדינמיקה של גרורות ב-PDAC היא צורך קריטי שלא נ....

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה (IACUC).

1. פסיבציה של חלונות

הערה: פסיבציה של נירוסטה מנקה את המתכת ממזהמים ויוצרת שכבת תחמוצת דקה המגבירה מאוד את התאימות הביולוגית של המתכת לרקמות רכות, אפילו מעבר לזו של טיטניום16.

  1. התחל את תהליך הפסיבציה על ידי שטיפת מסגרות החלון האופטיות בתמיסת דטרגנט פעילה אנזימטית 1% (w/v).
  2. טבלו את המסגרות בתמיסת נתרן הידרוקסידי 5% (w/v) בטמפרטורה של 70°C למשך 30 דקות בתוך צנצנת זכוכית.
  3. ....

תוצאות

איור 1, שהותאם מ-Du et al.15, מראה תמונות סטילס מסרט IVI בהילוך מהיר של הלבלב המורין. ניתן לראות תנועה מסוימת של רקמות במהלך תקופת השקיעה הראשונית (השעה הראשונה של ההדמיה, איור 1A). אולם עם המשך ההדמיה לאחר תקופת השקיעה הזו (>75 דקות), ראינו עלייה ביציבות הצ.......

Discussion

פרוטוקול SWIP המתואר כאן מספק שיטה משופרת לייצוב רקמת הלבלב על ידי שימוש בטכניקת סל תפר צולב. חלונות דימות בטן מוקדמים (AIWs) אפשרו הדמיה תוך חיונית (IVI) של איברים פנימיים של הבטן, אך לא הגבילו במידה מספקת את תנועת הרקמות הרכות כגון הלבלב. בתגובה, פארק ועמיתיו פיתחו חלון הדמיה לבלב (PIW) המשלב מדף מ?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

קרן הצדקה ע"ש אוולין ליפר, מרכז גרוס-ליפר לביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת T-32 של NIH (CA200561) ומענק של תוכנית מחקר סרטן הלבלב של משרד ההגנה (PCARP) PA210223P1.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergentAlconox IncNAConcentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxideSigma-AldrichS8045Passivation reagent
5 mm cover glassElectron Microscopy Sciences72296-05Round Glass Coverslips 
7% (w/v) solution of citric acidSigma-Aldrich 251275Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin SyringeBD329410Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibiotic
Bench Mount Heat LampMcMaster-Carr3349K51Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mLCovetrus North America059122Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved ScissorsWorld Precision InstrumentsWP2220Scissor for cutting tissue
C57BL/6J MouseJackson Laboratory000664 C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solutionDurvet7-45801-10258-3Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canisterFalconDPSJB-12Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel SuperglueStaples234790-6Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid SuperglueStaplesLOC1647358Coverslip Glue
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery Pen
Germinator 500CellPoint ScientificGER 5287-120VBead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" LengthRoboz SurgicalRS-5135 Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscopeNANASee Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging softwareNANASee Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033Isoflurane Anesthesia
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Kim Wipes
Laboratory tapeFisher Scientific159015RLaboratory Tape
Mouse Dissecting KitWorld Precision InstrumentsMOUSEKITSurgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter SensorKent Scientific CorpoMSTAT Sensor-MSEPulse Oximeter
Mouse SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Heated platform
Nair Hair Removal LotionAmazonB001RVMR7KDepilatory Lotion
OxygenTechAirOX TMOxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0VWR95056-872Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteHeated Platform Controller
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific867WCNOGLUECotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µLDenville Scientific Inc.P1125100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–DextranSigma-AldrichT1287-500MGVascular Label
Window-fixturing plateNANACustom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window FrameNANAThe window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].

References

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SWIPPDAC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved