A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.
הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלבלב מורכבות. מחלות הלבלב, כגון דלקת הלבלב ואדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) הן בעלות תחלואה ותמותה גבוהות. הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות הן במצב בריא והן במצב חולה, ומאפשרת תצפית בזמן אמת על הדינמיקה של התא. IVI של הלבלב המורין מציב אתגרים משמעותיים בשל האופי הקרבי העמוק והתואם של האיבר, מה שהופך אותו למועד מאוד לנזק ותנועה.
מתואר כאן תהליך ההשתלה של Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). SWIP מאפשר IVI של הלבלב murine במצבים בריאים נורמליים, במהלך המעבר מהלבלב הבריא לדלקת לבלב חריפה הנגרמת על ידי cerulein, ובמצבים ממאירים כגון גידולים בלבלב. בשילוב עם תאים המסומנים גנטית או מתן צבעים פלואורסצנטיים, SWIP מאפשר מדידה של דינמיקה של תא בודד ותת-תאי (כולל הגירה חד-תאית וקולקטיבית) כמו גם הדמיה סדרתית של אותו אזור עניין במשך מספר ימים.
היכולת ללכוד נדידת תאי גידול היא בעלת חשיבות מיוחדת מכיוון שהגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן ב- PDAC הוא הנטל הגרורתי העצום. הבנת הדינמיקה הפיזיולוגית של גרורות ב- PDAC היא צורך קריטי שלא נענה וחיוני לשיפור הפרוגנוזה של המטופל. בסך הכל, SWIP מספק יציבות הדמיה משופרת ומרחיב את היישום של IVI בלבלב בריא ומחלות לבלב ממאירות.
מחלות לבלב שפירות וממאירות עלולות לסכן חיים, עם פערים ניכרים בהבנת הפתופיזיולוגיה שלהן. דלקת הלבלב - דלקת בלבלב - היא הגורם השלישי בחשיבותו לאשפוזים ואשפוזים חוזרים הקשורים למחלות במערכת העיכול בארה"ב והיא קשורה לתחלואה משמעותית, תמותה ונטל סוציו-אקונומי1. מדורג כגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן2, אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) מהווה את רוב הממאירויות בלבלב3 ומבשר על שיעור הישרדות גרוע של 5 שנים של 11% בלבד 2. הגורם המוביל לתמותה מסרטן ב-PDAC הוא עומס גרורתי עצום. למרבה הצער, רוב החולים נוכחים עם מחלה גרורתית. לכן, הבנת הדינמיקה של גרורות ב-PDAC היא צורך קריטי שלא נ....
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה (IACUC).
1. פסיבציה של חלונות
הערה: פסיבציה של נירוסטה מנקה את המתכת ממזהמים ויוצרת שכבת תחמוצת דקה המגבירה מאוד את התאימות הביולוגית של המתכת לרקמות רכות, אפילו מעבר לזו של טיטניום16.
איור 1, שהותאם מ-Du et al.15, מראה תמונות סטילס מסרט IVI בהילוך מהיר של הלבלב המורין. ניתן לראות תנועה מסוימת של רקמות במהלך תקופת השקיעה הראשונית (השעה הראשונה של ההדמיה, איור 1A). אולם עם המשך ההדמיה לאחר תקופת השקיעה הזו (>75 דקות), ראינו עלייה ביציבות הצ.......
פרוטוקול SWIP המתואר כאן מספק שיטה משופרת לייצוב רקמת הלבלב על ידי שימוש בטכניקת סל תפר צולב. חלונות דימות בטן מוקדמים (AIWs) אפשרו הדמיה תוך חיונית (IVI) של איברים פנימיים של הבטן, אך לא הגבילו במידה מספקת את תנועת הרקמות הרכות כגון הלבלב. בתגובה, פארק ועמיתיו פיתחו חלון הדמיה לבלב (PIW) המשלב מדף מ?.......
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
קרן הצדקה ע"ש אוולין ליפר, מרכז גרוס-ליפר לביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת T-32 של NIH (CA200561) ומענק של תוכנית מחקר סרטן הלבלב של משרד ההגנה (PCARP) PA210223P1.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
Cyano acrylate - Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
Cyano acrylate - Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved