Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей

Резюме

Представлен протокол хирургической имплантации стабилизированного постоянного оптического окна для субклеточной визуализации поджелудочной железы мышей, позволяющий проводить серийные и лонгитюдные исследования здоровой и больной поджелудочной железы.

Аннотация

Физиология и патофизиология поджелудочной железы сложны. Заболевания поджелудочной железы, такие как панкреатит и аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью. Прижизненная визуализация (ВВИ) — это мощный метод, позволяющий получать изображения тканей с высоким разрешением как в здоровом, так и в больном состоянии, что позволяет наблюдать за динамикой клеток в режиме реального времени. ИВИ поджелудочной железы мышей представляет собой серьезную проблему из-за глубокой висцеральной и податливой природы органа, что делает его очень подверженным повреждениям и артефактам движения.

Здесь описан процесс имплантации S-табилизированного W-индудля визуализациимышиного P-ancreas(SWIP). SWIP позволяет проводить внутривенное введение поджелудочной железы мышей в нормальном здоровом состоянии, во время трансформации здоровой поджелудочной железы в острый панкреатит, индуцированный церулеином, и при злокачественных состояниях, таких как опухоли поджелудочной железы. В сочетании с генетически мечеными клетками или введением флуоресцентных красителей, SWIP позволяет измерять динамику одиночных клеток и субклеток (включая одноклеточную и коллективную миграцию), а также получать последовательные изображения одной и той же области интереса в течение нескольких дней.

Способность улавливать миграцию опухолевых клеток имеет особое значение, поскольку основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является подавляющее метастатическое бремя. Понимание физиологической динамики метастазирования при ОАК является критической неудовлетворенной потребностью и имеет решающее значение для улучшения прогноза пациента. В целом, SWIP обеспечивает улучшенную стабильность визуализации и расширяет область применения IVI при здоровых заболеваниях поджелудочной железы и злокачественных заболеваниях поджелудочной железы.

Введение

Доброкачественные и злокачественные заболевания поджелудочной железы потенциально опасны для жизни, при этом существуют значительные пробелы в понимании их патофизиологии. Панкреатит – воспаление поджелудочной железы – является третьей по значимости причиной госпитализаций и повторных госпитализаций в связи с желудочно-кишечными заболеваниями в США и связан со значительной заболеваемостью, смертностью и социально-экономическим бременем^. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), занимающая третье место среди основных^{причин смертности}, связанной с раком, является причиной большинства злокачественных новообразо....

протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Институционального комитета по уходу за животными и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).

1. Пассивация окон

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассивация нержавеющей стали очищает металл от загрязнений и создает тонкий оксидный слой, который значительно повышает биосовместимость металла с мягкими тканями, даже по сравнению с титаном¹⁶.

1. Начните процесс пассивации, промыв оп....

Результаты

На рисунке 1, адаптированном из Du et ^al.15, показаны кадры из покадрового видеоролика IVI мышиной поджелудочной железы. Некоторое движение тканей можно наблюдать в течение начального периода успокоения (первый час визуализации, рис. 1А). Однако пр?.......

Обсуждение

Протокол SWIP, описанный здесь, обеспечивает улучшенный метод стабилизации тканей поджелудочной железы с использованием техники вышивки корзиной крестиком. Ранние окна визуализации брюшной полости (AIW) позволяли проводить прижизненную визуализацию (IVI) внутренних органов брюшной полос.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].