Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей

Резюме

Представлен протокол хирургической имплантации стабилизированного постоянного оптического окна для субклеточной визуализации поджелудочной железы мышей, позволяющий проводить серийные и лонгитюдные исследования здоровой и больной поджелудочной железы.

Аннотация

Физиология и патофизиология поджелудочной железы сложны. Заболевания поджелудочной железы, такие как панкреатит и аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью. Прижизненная визуализация (ВВИ) — это мощный метод, позволяющий получать изображения тканей с высоким разрешением как в здоровом, так и в больном состоянии, что позволяет наблюдать за динамикой клеток в режиме реального времени. ИВИ поджелудочной железы мышей представляет собой серьезную проблему из-за глубокой висцеральной и податливой природы органа, что делает его очень подверженным повреждениям и артефактам движения.

Здесь описан процесс имплантации S-табилизированного W-индудля визуализациимышиного P-ancreas(SWIP). SWIP позволяет проводить внутривенное введение поджелудочной железы мышей в нормальном здоровом состоянии, во время трансформации здоровой поджелудочной железы в острый панкреатит, индуцированный церулеином, и при злокачественных состояниях, таких как опухоли поджелудочной железы. В сочетании с генетически мечеными клетками или введением флуоресцентных красителей, SWIP позволяет измерять динамику одиночных клеток и субклеток (включая одноклеточную и коллективную миграцию), а также получать последовательные изображения одной и той же области интереса в течение нескольких дней.

Способность улавливать миграцию опухолевых клеток имеет особое значение, поскольку основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является подавляющее метастатическое бремя. Понимание физиологической динамики метастазирования при ОАК является критической неудовлетворенной потребностью и имеет решающее значение для улучшения прогноза пациента. В целом, SWIP обеспечивает улучшенную стабильность визуализации и расширяет область применения IVI при здоровых заболеваниях поджелудочной железы и злокачественных заболеваниях поджелудочной железы.

Введение

Доброкачественные и злокачественные заболевания поджелудочной железы потенциально опасны для жизни, при этом существуют значительные пробелы в понимании их патофизиологии. Панкреатит – воспаление поджелудочной железы – является третьей по значимости причиной госпитализаций и повторных госпитализаций в связи с желудочно-кишечными заболеваниями в США и связан со значительной заболеваемостью, смертностью и социально-экономическим бременем^. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), занимающая третье место среди основных^{причин смертности}, связанной с раком, является причиной большинства злокачественных новообразований поджелудочной железы³ и предвещает низкую 5-летнюю выживаемость — всего 11%². Основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является чрезмерная метастатическая нагрузка. К сожалению, у большинства пациентов наблюдается метастатическое заболевание. Таким образом, понимание динамики метастазирования при PDAC является критической неудовлетворенной потребностью в области исследования рака.

Механизмы, лежащие в основе воспаления и метастатического каскада поджелудочной железы, плохо изучены. Основной причиной этого пробела в знаниях является невозможность наблюдать клеточную динамику поджелудочной железы in vivo. Непосредственное наблюдение за этой клеточной динамикой обещает выявить важнейшие мишени для использования и улучшения диагностики и лечения пациентов с заболеваниями поджелудочной железы.

Прижизненная визуализация (ВВИ) — это метод микроскопии, который позволяет исследователям визуализировать и изучать биологические процессы у живых животных в режиме реального времени. IVI позволяет с высоким разрешением напрямую визуализировать динамику внутриклеточной и микроокружающей среды in vivo и в естественной среде рассматриваемого биологического процесса. Таким образом, IVI позволяет in vivo наблюдать за здоровыми и патологическими процессами.

Современные методы визуализации всего тела, такие как МРТ, ПЭТ и КТ, обеспечивают превосходное изображение целых органов и могут выявлять патологии еще до появления клинических симптомов⁴. Однако они не способны достичь одноклеточного разрешения или выявить самые ранние стадии заболевания – панкреатита или злокачественных новообразований.

В предыдущих исследованиях для наблюдения за доброкачественными и злокачественными заболеваниями кожи^5,6, молочной железы⁷, легких⁸, печени⁹, головного мозга¹⁰ и поджелудочной железы 11 использовалось одноклеточное разрешение^, что привело к пониманию механизмов прогрессирования заболевания¹². Тем не менее, поджелудочная железа мышей создает значительные препятствия для достижения разрешения одной клетки с помощью IVI, в первую очередь из-за ее глубокого висцерального расположения и высокой податливости. Кроме того, это разветвленный, диффузно распределенный орган в брыжейке, который соединяется с селезенкой, тонкой кишкой и желудком, что затрудняет доступ к нему. Ткань также очень чувствительна к движению, вызванному прилегающей перистальтикой и дыханием. Минимизация движения поджелудочной железы имеет важное значение для микроскопии с одноклеточным разрешением, поскольку артефакты движения даже в несколько микрон могут размывать и искажать изображения, что делает невозможным отслеживание динамики отдельных клеток¹³.

Для проведения ВВИ хирургическим путем должно быть имплантировано окно визуализации брюшной полости (AIW) ^9,11. Для хирургической имплантации AIW в брюшную стенку вшивается металлическая оконная рама. После этого интересующий орган крепится к каркасу с помощью цианоакрилатного клея. Хотя этого достаточно для некоторых жестких внутренних органов (например, печени, селезенки, ригидных опухолей), попытки визуализации здоровой поджелудочной железы мышей нарушаются из-за неоптимальной латеральной и осевой стабильности из-за податливой текстуры ткани и сложной архитектуры¹⁴. Чтобы устранить это ограничение, Park et ^al.14 разработали окно визуализации, специально предназначенное для здоровой поджелудочной железы. Это окно визуализации поджелудочной железы (PIW) сводит к минимуму влияние кишечника и дыхания за счет горизонтальной металлической полки в оконной раме, прямо под покровным стеклом, стабилизируя ткань и поддерживая ее контакт с покровным стеклом. Несмотря на то, что PIW обеспечивает повышенную латеральную стабильность, мы обнаружили, что это окно по-прежнему демонстрирует осевой дрейф и дополнительно препятствует визуализации крупных солидных опухолей из-за узкого зазора между металлической полкой и покровным стеклом¹⁵.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали S-табилизированный W-индудля визуализации мышиного P-ancreas(SWIP), имплантируемое окно визуализации, способное обеспечить стабильную долгосрочную визуализацию как здоровой, так и больной поджелудочной железы (рис. 1⁾¹⁵. Здесь мы предоставляем исчерпывающий протокол хирургической процедуры, используемой для имплантации SWIP. Хотя основной целью было изучение динамических механизмов, участвующих в метастазировании, этот метод также может быть использован для изучения различных аспектов биологии и патологии поджелудочной железы.

протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Институционального комитета по уходу за животными и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).

1. Пассивация окон

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассивация нержавеющей стали очищает металл от загрязнений и создает тонкий оксидный слой, который значительно повышает биосовместимость металла с мягкими тканями, даже по сравнению с титаном¹⁶.

1. Начните процесс пассивации, промыв оптические оконные рамы 1% (w/v) раствором ферментативно-активного моющего средства.
2. Погрузите рамы в 5%-ный раствор гидроксида натрия при температуре 70 °C на 30 минут в стеклянную банку.
3. Выньте рамки и промойте их деионизированной водой.
4. Погрузите рамы в 7%-ный раствор лимонной кислоты при температуре 55 °C на 10 минут в новую стеклянную банку.
5. Снимите рамки и снова промойте их деионизированной водой.
6. Повторите шаг 1.2 и, наконец, промойте оконные рамы деионизированной водой в последний раз.

2. Подготовка к имплантации опухоли или операции на окне

ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования опухолей поджелудочной железы опухолевые клетки должны быть имплантированы и позволить им вырасти в явные опухоли. Для визуализации опухолевых клеток in vivo рекомендуется использовать клетки, которые были генетически изменены для экспрессии флуоресцентных белков, таких как Dendra2. Использование флуоресцентных белковых меток, которые являются яркими, смягчит потенциальные проблемы с автофлуоресценцией тканей. Другие потенциальные флуоресцентные белки, красители и генетически кодируемые флуоресцентные модели мышей, которые могут быть использованы, обсуждались в других статьях^17,18. Чтобы предотвратить загрязнение операционного поля, выполняйте хирургическую процедуру в вытяжке или ламинарном кабинете и убедитесь, что отдельные области используются для подготовки, операции и восстановления.

1. Перед операцией простерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве и, при необходимости, используйте стерилизатор горячими шариками для последующих процедур. Убедитесь, что операция проводится только с помощью наконечников.
2. Включите хирургическую прокладку с подогревом и стерилизатор шариков и подождите, пока они не достигнут соответствующей рабочей температуры. Температуру грелки следует контролировать с помощью поверхностного термометра, чтобы избежать возможных ожогов. Положите стерильную ткань на грелку, если температуру невозможно должным образом контролировать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела во время коротких процедур (≤20 мин), таких как имплантация опухоли и окна, минимально снижается при использовании хирургической подушки с подогревом. Однако более длительные периоды анестезии, например, во время длительной таймлапс-визуализации, требуют, чтобы мышь была помещена в обогреваемую камеру для поддержания температуры тела.
3. Обезболивайте мышь 5% изофлураном в наркозной камере.
4. Критический шаг: Снизьте уровень анестезии до 2%, как только мышь потеряет сознание. Внимательно следите за уровнем анестезии и жизненно важными показателями мыши (например, с помощью пульсоксиметра)¹⁹.
5. Нанесите маленькую каплю смазки для глаз на каждый глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
6. Перед операцией обильно нанесите крем для депиляции на левую верхнюю часть живота, чтобы удалить волосы. Через 20 секунд используйте смоченную папиросную бумагу, чтобы плотно вытереть волосы и крем для депиляции. Повторяйте процесс по мере необходимости до тех пор, пока все волосы не будут удалены из области операции.
7. Ввести 10 мкл бупренорфина (0,1 мг/кг), разведенного в 90 мкл PBS, подкожно, для обеспечения предоперационной анальгезии.

3. Имплантация опухоли поджелудочной железы

1. Готовят аликвоты опухолевых клеток в нужной концентрации (исходя из времени удвоения опухолевых клеток). Поместите клеточную суспензию в инсулиновый шприц и держите на льду. Для следования этому протоколу используют 10⁶ сингенных опухолевых клеток KPC 20, взвешенных в максимуме 50 мкл PBS, в соответствии с протоколом ортотопической инъекции, адаптированным из Erstad et^al.21
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта клеточная линия, введенная в такой концентрации, обычно вызывала пальпируемые или соответственно большие опухоли к 10-14 дням. Субклоны этой клеточной линии и других клеточных линий поджелудочной железы должны быть оценены на наличие соответствующих концентраций и сроков для получения опухолей соответствующего размера.
2. Вымойте руки с использованием антисептического мыла.
3. Перед каждой новой операцией надевайте новые стерильные перчатки.
4. Перенесите мышь в стерильный хирургический капюшон и поместите ее в положение частичного правого бока пролежни.
5. Закрепите конечности бумажной лентой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное использование инструментов важно на протяжении всей процедуры. Примеры того, как держать щипцы, ножницы Кастровьехо и вакуумный захват, показаны на рисунке 2A-C.
6. Простерилизуйте брюшную полость антисептиком (рисунок 2D).
7. Убедитесь, что животное полностью обезболино, выполнив тест на защемление пальца ноги.
8. Сделайте левый подреберный разрез на коже диаметром 10-15 мм с помощью щипцов и ножниц Кастровьехо (рис. 2E).
9. Контролируйте гемостаз с помощью ватных палочек или шприц-ручки для прижигания, когда это необходимо.
10. Осторожно разделите нижележащую мышцу щипцами и ножницами Кастровьехо, чтобы войти в брюшину (Рисунок 2F).
11. С помощью стерильных ватных тампонов атравматично экстернализовать поджелудочную железу и селезенку.
12. Растопырите поджелудочную железу так, чтобы не было складок (рис. 2G).
13. Определите желаемое место инъекции опухоли в теле или хвосте поджелудочной железы (вдали от кровеносных сосудов).
14. Критический шаг: После тщательного позиционирования поджелудочной железы используйте щипцы, чтобы обеспечить натяжение ткани, и введите наконечник инсулинового шприца скосом вверх в нужный участок поджелудочной железы на глубину 4-5 мм (Рисунок 2H).
15. Медленно вводят раствор опухолевых клеток. Найдите небольшой пузырь, подтверждающий успешную инъекцию (рисунок 2I).
16. Осторожно верните поджелудочную железу в брюшную полость, не нарушая пузырь для инъекции опухолевых клеток (рис. 2J).
17. Используя рассасывающиеся полидиоксаноновые нити 5-0, сначала закройте мышечный слой, а затем кожу прерывистыми швами (рис. 2K-N).
18. Покройте разрез цианоакрилатным клеем (рис. 2O), затем верните мышь в чистую клетку под нагревательной лампой для восстановления. Добавляйте антибиотики в питьевую воду, чтобы предотвратить инфекцию. Наблюдайте за мышами и дайте им полностью восстановиться после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики назначаются в соответствии с требованиями протокола IACUC. Все животные размещаются индивидуально.
19. Дайте опухоли развиваться в течение 10-14 дней, пока она не пропальпируется через брюшную стенку.

4. Операция на окне поджелудочной железы

1. Когда животные будут готовы к визуализации, начните операцию по имплантации окна. Для начала вымойте руки с антисептическим мылом.
2. Перед каждой новой операцией надевайте свежие стерильные перчатки.
3. На хирургической подставке с подогревом поместите мышь в положение правого бокового пролежня, чтобы обнажить левый живот.
4. Прикрепите передние и задние конечности мыши к нагретому операционному этапу краниально и каудально с помощью бумажной ленты. Убедитесь, что селезенка (под кожей) видна в пределах операционного поля (Рисунок 3A).
5. Для сохранения стерильности распакуйте все хирургические инструменты в капюшоне.
6. Продезинфицируйте место операции, промыв кожу мыши обильным антисептиком.
7. Убедитесь, что животное полностью обезболино, выполнив тест на защемление пальца ноги.
8. Критический шаг: Приподнимите кожу левого верхнего квадранта живота щипцами и сделайте круговой разрез на коже и мускулатуре диаметром ~10 мм с помощью ножниц Кастровьехо (рис. 3B, C).
9. Остановите кровотечение и поддерживайте гемостаз с помощью ватных палочек или шприца, если это необходимо.
10. Локализовать поджелудочную железу, которая прикреплена к селезенке, и определить направление, в котором поджелудочная железа лежит внутри разреза, чтобы решить, где следует разместить поддерживающую вышивку крестом.
11. Используя шелковый шов 5-0, поместите первый стежок в нужном месте в мышечном слое. Завяжите этот конец 3-5 узлами. (Рисунок 3D,E)
12. Продолжайте накладывать швы непосредственно поперек разреза. Отрежьте и оставьте хвостик ~5 см (Рисунок 3F).
13. Повторите шаги 4.11 и 4.12 перпендикулярно первому стежку (рис. 3G,H).
14. Критический шаг: Осторожно приподнимите и расположите поджелудочную железу над вышивкой крестиком (рис. 3I, J). Следите за тем, чтобы не повредить поджелудочную железу во время манипуляции.
15. Критический этап: Используя шелковый шов 5-0, выполните кисетный стежок на расстоянии ~1 мм от отверстия по окружности, переплетая слой кожи и мышц (Рисунок 3K).
16. Расположите оконную раму так, чтобы края круглого разреза находились в пазе окна (Рисунок 3L).
17. Закрепите имплантированное окно, плотно завязав шелк 5-0.
18. В шприц объемом 1 мл налить 100 мкл жидкого цианоакрилатного клея.
19. Высушите ткань, применяя деликатный поток сжатого воздуха в течение ~10 с.
20. Обхватите оконную раму за внешний край щипцами и осторожно приподнимите, чтобы обеспечить отделение поджелудочной железы от нижней поверхности оконной рамы.
21. Критический шаг: Нанесите тонкий слой жидкого цианоакрилатного клея вдоль ниши окна (Рисунок 3M). Следите за тем, чтобы клей не попал на ткани поджелудочной железы.
22. С помощью вакуумных звукоснимателей поднимите 5-миллиметровый покровный щиток.
23. Осторожно поместите защитное стекло внутрь углубления в центре оптической оконной рамы. Удерживайте с легким давлением, позволяя цианоакрилатному клею схватиться (~25 с).
24. Отделите покровный листок от вакуумных пикапов с помощью щипцов.
25. Затяните швы для вышивки крестиком, чтобы поджелудочная железа плотно прилегала к покровному стеблю (Рисунок 3N, O). Примечание: Не перетягивайте вышивку крестиком, так как это может привести к повреждению и ишемии поджелудочной железы.
26. Обрежьте концы шва.
27. Снимите скотч с мыши.
28. Выключите испаритель изофлурана.
29. Переместите мышь в чистую клетку или непосредственно к прижизненному микроскопу.
30. Поместите животных в индивидуальное жилище после операции на окне и наблюдайте за ними до полного выздоровления.
31. Затем визуализация выполняется на двухлазерном многофотонном микроскопе, как мы описали ранее ^22,23,24 Для длительных сеансов визуализации мышь помещается в обогреваемую камеру для поддержания температуры тела и снабжается поддерживающими жидкостями в соответствии со стандартами IACUC.

5. Церулеин для индукции панкреатита

1. Чтобы исследовать начало панкреатита, лечат здоровых мышей церулеином после имплантации SWIP. Убедитесь, что мышей голодают в течение 14-18 ч и дают им воду вволю перед введением церулеина.
2. Вводят 50 мкг/кг церулеина в 100 мкл стерильного 1x DPBS внутрибрюшинно с интервалом в 1 ч до восьми инъекций. Вводят контрольным мышам эквивалентный объем 1x DPBS, вводимый внутрибрюшинно.
3. После визуализации жертвуют мышей через 24 ч после первой инъекции при вывихе шейки матки в соответствии со стандартами IACUC.
4. Выполните визуализацию на двухлазерном многофотонном микроскопе, как описано ранее ^22,23,24. Во время длительных сеансов визуализации поместите мышь в обогреваемую камеру, чтобы поддерживать температуру тела и обеспечить ее поддерживающими жидкостями в соответствии со стандартами IACUC.

Результаты

На рисунке 1, адаптированном из Du et ^al.15, показаны кадры из покадрового видеоролика IVI мышиной поджелудочной железы. Некоторое движение тканей можно наблюдать в течение начального периода успокоения (первый час визуализации, рис. 1А). Однако пр?...

Обсуждение

Протокол SWIP, описанный здесь, обеспечивает улучшенный метод стабилизации тканей поджелудочной железы с использованием техники вышивки корзиной крестиком. Ранние окна визуализации брюшной полости (AIW) позволяли проводить прижизненную визуализацию (IVI) внутренних органов брюшной полос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].