用于小鼠胰腺活体成像的稳定窗口

摘要

我们提出了一种手术植入稳定留置光学窗口的方案，用于小鼠胰腺的亚细胞分辨率成像，允许对健康和患病胰腺进行连续和纵向研究。

摘要

胰腺的生理学和病理生理学很复杂。胰腺疾病，如胰腺炎和胰腺癌（PDAC）的发病率和死亡率都很高。活体成像 （IVI） 是一种强大的技术，能够对健康和患病状态的组织进行高分辨率成像，从而可以实时观察细胞动力学。由于器官的深层内脏和顺应性，小鼠胰腺的 IVI 带来了重大挑战，这使得它极易受到损伤和运动伪影。

这里描述的是植入用于小鼠 Pancreas （SWIP） 的 Intravital 成像的 S稳定 W禀露的过程。SWIP允许小鼠胰腺在正常健康状态下，在从健康胰腺转变为蔚蓝诱导的急性胰腺炎期间，以及在胰腺肿瘤等恶性状态下进行IVI。结合基因标记的细胞或荧光染料的给药，SWIP可以测量单细胞和亚细胞动力学（包括单细胞和集体迁移），以及在多天内对同一感兴趣区域进行连续成像。

捕获肿瘤细胞迁移的能力尤为重要，因为 PDAC 中癌症相关死亡的主要原因是压倒性的转移负担。了解 PDAC 转移的生理动力学是一项关键的未满足需求，对于改善患者预后至关重要。总体而言，SWIP提供了更好的成像稳定性，并扩大了IVI在健康胰腺和恶性胰腺疾病中的应用。

引言

良性和恶性胰腺疾病可能危及生命，对其病理生理学的理解存在相当大的差距。胰腺炎（胰腺炎症）是美国胃肠道疾病相关住院和再入院的第三大原因，与大量发病率、死亡率和社会经济负担相关¹.胰腺导管腺癌 （PDAC） 是癌症相关死亡的第三大原因 2，占大多数胰腺恶性肿瘤³，预示着 5 年生存率仅为 11%²。PDAC癌症相关死亡的主要原因是压倒性的转移负担。不幸的是，大多数患者表现为转移性疾病。因此，了解PDAC转移的动态是癌症研究领域中一个关键的未满足需求。

炎症和胰腺转移级联反应的机制知之甚少。造成这种知识差距的一个主要因素是无法在 体内观察胰腺细胞动力学。对这些细胞动力学的直接观察有望揭示关键靶点，以利用和改善胰腺疾病患者的诊断和治疗。

活体成像 （IVI） 是一种显微镜技术，使研究人员能够实时可视化和研究活体动物的生物过程。IVI允许在 体内 和所讨论的生物过程的天然环境中对细胞内和微环境动力学进行高分辨率、直接的可视化。因此，IVI允许对健康和病理过程 进行体内 观察。

MRI、PET 和 CT 等现代全身成像方式提供了整个器官....

研究方案

本协议中描述的所有程序均已按照脊椎动物使用的指南和规定执行，包括阿尔伯特爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的事先批准。

1.窗户的钝化

注意：不锈钢的钝化可以清除金属中的污染物并形成一层薄的氧化层，从而大大提高金属与软组织的生物相容性，甚至超过钛¹⁶。

1. 通过用 1% （w/v） 酶活性洗涤剂溶液清洗光学窗框来开始钝化过程。
2. 将框架浸没在70°C的5%（w / v）氢氧化钠溶液中30分钟。
3. 取出镜框并用去离子水冲洗。
4. 将框架浸入55°C的7%（w / v）柠檬酸溶液中10分钟。
5. 取下框架并再次用去离子水冲洗。
6. 重复步骤1.2，最后，最后一次用去离子水冲洗窗框。

2.肿瘤植入或视窗手术的准备

注意：对于胰腺肿瘤的研究，必须植入肿瘤细胞并允许其生长成明显的肿瘤。为了在体内观察肿瘤细胞，建议使用经过基因改变以表达荧光蛋白（如Dendra2）的细胞。使用明亮的荧光蛋白标记物将减轻组织自发荧光的潜在问题。其他可能使用的荧光蛋白、染料和基因编码的荧光....

讨论

这里描述的SWIP协议通过利用十字绣篮技术提供了一种改进的胰腺组织稳定方法。早期的腹部成像窗口 （AIW） 能够对腹部内脏器官进行活体成像 （IVI），但不能充分限制胰腺等软组织的运动。作为回应，Park等人开发了一种胰腺成像窗口（PIW），该窗口包含一个水平金属架子，可以提高胰腺组织的稳定性，同时保持与玻璃盖玻片的接触。虽然这种方法提高了横向稳定性，但它限制了实体胰腺肿瘤?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].