用于小鼠胰腺活体成像的稳定窗口

摘要

我们提出了一种手术植入稳定留置光学窗口的方案，用于小鼠胰腺的亚细胞分辨率成像，允许对健康和患病胰腺进行连续和纵向研究。

摘要

胰腺的生理学和病理生理学很复杂。胰腺疾病，如胰腺炎和胰腺癌（PDAC）的发病率和死亡率都很高。活体成像 （IVI） 是一种强大的技术，能够对健康和患病状态的组织进行高分辨率成像，从而可以实时观察细胞动力学。由于器官的深层内脏和顺应性，小鼠胰腺的 IVI 带来了重大挑战，这使得它极易受到损伤和运动伪影。

这里描述的是植入用于小鼠 Pancreas （SWIP） 的 Intravital 成像的 S稳定 W禀露的过程。SWIP允许小鼠胰腺在正常健康状态下，在从健康胰腺转变为蔚蓝诱导的急性胰腺炎期间，以及在胰腺肿瘤等恶性状态下进行IVI。结合基因标记的细胞或荧光染料的给药，SWIP可以测量单细胞和亚细胞动力学（包括单细胞和集体迁移），以及在多天内对同一感兴趣区域进行连续成像。

捕获肿瘤细胞迁移的能力尤为重要，因为 PDAC 中癌症相关死亡的主要原因是压倒性的转移负担。了解 PDAC 转移的生理动力学是一项关键的未满足需求，对于改善患者预后至关重要。总体而言，SWIP提供了更好的成像稳定性，并扩大了IVI在健康胰腺和恶性胰腺疾病中的应用。

引言

良性和恶性胰腺疾病可能危及生命，对其病理生理学的理解存在相当大的差距。胰腺炎（胰腺炎症）是美国胃肠道疾病相关住院和再入院的第三大原因，与大量发病率、死亡率和社会经济负担相关¹.胰腺导管腺癌 （PDAC） 是癌症相关死亡的第三大原因 2，占大多数胰腺恶性肿瘤³，预示着 5 年生存率仅为 11%²。PDAC癌症相关死亡的主要原因是压倒性的转移负担。不幸的是，大多数患者表现为转移性疾病。因此，了解PDAC转移的动态是癌症研究领域中一个关键的未满足需求。

炎症和胰腺转移级联反应的机制知之甚少。造成这种知识差距的一个主要因素是无法在 体内观察胰腺细胞动力学。对这些细胞动力学的直接观察有望揭示关键靶点，以利用和改善胰腺疾病患者的诊断和治疗。

活体成像 （IVI） 是一种显微镜技术，使研究人员能够实时可视化和研究活体动物的生物过程。IVI允许在 体内 和所讨论的生物过程的天然环境中对细胞内和微环境动力学进行高分辨率、直接的可视化。因此，IVI允许对健康和病理过程 进行体内 观察。

MRI、PET 和 CT 等现代全身成像方式提供了整个器官的极好视图，甚至可以在临床症状出现之前揭示病理⁴.然而，它们无法达到单细胞分辨率或揭示疾病的早期阶段——胰腺炎或恶性肿瘤。

先前的研究使用单细胞分辨率 IVI 观察皮肤^5,6、乳腺⁷、肺⁸、肝⁹、脑 10 和胰腺肿瘤 11 的良性和恶性疾病^，从而深入了解疾病进展的机制 ¹²。然而，小鼠胰腺对使用 IVI 实现单细胞分辨率构成了重大障碍，这主要是由于其深脏位置和高依从性。此外，它是肠系膜内一个分支的、弥漫分布的器官，与脾脏、小肠和胃相连，使其难以进入。该组织对邻近蠕动和呼吸引起的运动也高度敏感。最小化胰腺的运动对于单细胞分辨率显微镜至关重要，因为即使是几微米的运动伪影也会使图像模糊和扭曲，从而无法跟踪单个细胞的动态¹³.

要进行 IVI，必须通过手术植入腹部成像窗口 （AIW） ^9,11。为了通过手术植入 AIW，将金属窗框缝合到腹壁中。之后，使用氰基丙烯酸酯粘合剂将感兴趣的器官连接到框架上。虽然这对于一些刚性内脏器官（例如肝脏、脾脏、刚性肿瘤）来说已经足够了，但由于组织的顺应质地和复杂的结构，对健康小鼠胰腺进行成像的尝试会受到次优横向和轴向稳定性的影响¹⁴.为了解决这一局限性，Park等人^[14]开发了一种专门为健康胰腺设计的成像窗口。该胰腺成像窗口 （PIW） 通过在盖玻片下方的窗框内加入一个水平金属架子，稳定组织并保持其与盖玻片的接触，最大限度地减少肠道运动和呼吸的影响。虽然 PIW 提供了更高的横向稳定性，但我们发现该窗口仍然表现出轴向漂移，并且由于金属架和^{Coverslip 15} 之间的狭窄间隙，还阻止了大型实体瘤的成像。

为了解决这些局限性，我们开发了用于小鼠 Pancreas 的 Intravital 成像的 S稳定 Window （SWIP），这是一种植入式成像窗口，能够实现健康和患病胰腺的稳定长期成像（图 1）¹⁵。在这里，我们为用于植入 SWIP 的外科手术提供了全面的方案。虽然主要目的是研究转移的动态机制，但这种方法也可用于探索胰腺生物学和病理学的各个方面。

研究方案

本协议中描述的所有程序均已按照脊椎动物使用的指南和规定执行，包括阿尔伯特爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的事先批准。

1.窗户的钝化

注意:不锈钢的钝化可以清除金属中的污染物并形成一层薄的氧化层，从而大大提高金属与软组织的生物相容性，甚至超过钛¹⁶。

1. 通过用 1% （w/v） 酶活性洗涤剂溶液清洗光学窗框来开始钝化过程。
2. 将框架浸没在70°C的5%（w / v）氢氧化钠溶液中30分钟。
3. 取出镜框并用去离子水冲洗。
4. 将框架浸入55°C的7%（w / v）柠檬酸溶液中10分钟。
5. 取下框架并再次用去离子水冲洗。
6. 重复步骤1.2，最后，最后一次用去离子水冲洗窗框。

2.肿瘤植入或视窗手术的准备

注意:对于胰腺肿瘤的研究，必须植入肿瘤细胞并允许其生长成明显的肿瘤。为了在体内观察肿瘤细胞，建议使用经过基因改变以表达荧光蛋白（如Dendra2）的细胞。使用明亮的荧光蛋白标记物将减轻组织自发荧光的潜在问题。其他可能使用的荧光蛋白、染料和基因编码的荧光小鼠模型已在别处讨论^{过 17,18}。为防止手术区域受到污染，请在罩或层流柜中进行外科手术，并确保使用不同的区域进行准备、手术和恢复。

1. 手术前，在高压灭菌器中对所有手术器械进行消毒，如有必要，使用热珠灭菌器进行后续手术。确保手术采用仅提示技术。
2. 打开加热的手术垫和珠子消毒器，等待其达到合适的工作温度。加热垫温度应使用表面温度计监测，以避免潜在的灼伤。如果温度无法充分控制，请将无菌布放在加热垫上。
   注意:使用加热的手术垫时，短期手术（≤20 分钟）期间的体温（例如肿瘤和窗口植入）受到的影响最小。然而，较长时间的麻醉，例如在延长的延时成像期间，需要将小鼠置于加热室中以保持体温。
3. 在麻醉室中用5%异氟烷麻醉小鼠。
4. 关键步骤:一旦小鼠失去知觉，将麻醉降低到 2%。仔细监测麻醉水平和小鼠的生命体征（例如，使用脉搏血氧仪）¹⁹。
5. 在小鼠的每只眼睛上滴一小滴眼部润滑剂，以防止角膜干燥。
6. 手术前，将脱毛膏大量涂抹在左上腹部以去除毛发。20秒后，用湿纸巾用力擦去毛发和脱毛膏。根据需要重复该过程，直到从手术区域去除所有毛发。
7. 皮下注射 10 μL 在 90 μL PBS 中稀释的丁丙诺啡 （0.1 mg/kg），以确保术前镇痛。

3.胰腺肿瘤植入术

1. 制备所需浓度的肿瘤细胞等分试样（基于肿瘤细胞倍增时间）。将细胞悬浮液放入胰岛素注射器中，并将其保持在冰上。为了遵循该方案，使用10⁶ 个同基因KPC肿瘤细胞²⁰ 悬浮在最多50μL的PBS中，遵循改编自Erstad等人的原位注射方案²¹
   注意:以该浓度注射的该细胞系通常会在 10-14 天内产生可触及或适当大的肿瘤。需要评估该细胞系和其他胰腺细胞系的亚克隆，以产生适当大小的肿瘤。
2. 用消毒肥皂洗手。
3. 在每次新手术之前，戴上新的无菌手套。
4. 将鼠标转移到无菌手术罩上，并将其置于部分右侧卧位。
5. 用纸胶带固定四肢。
   注意: 在整个过程中正确使用仪器很重要。图 2A-C 显示了如何握住镊子、Castroviejo 剪刀和真空拾取工具的示例。
6. 用消毒剂对腹部进行消毒（图2D）。
7. 通过进行脚趾捏合测试确保动物完全麻醉。
8. 使用镊子和Castroviejo剪刀在皮肤上做一个10-15毫米的左肋下切口（图2E）。
9. 必要时/必要时使用棉签或烧灼笔控制止血。
10. 用镊子和卡斯特罗维霍剪刀小心地分开下面的肌肉以进入腹膜（图2F）。
11. 使用无菌棉签，对胰腺和脾脏进行无创伤外化。
12. 将胰腺张开，这样就不会有褶皱（图2G）。
13. 确定胰腺体或尾部（远离血管）中所需的肿瘤注射部位。
14. 关键步骤:仔细定位胰腺后，使用镊子为组织提供张力，并将胰岛素注射器尖端插入胰腺的所需部位，斜面朝上，深度为4-5毫米（图2H）。
15. 缓慢注射肿瘤细胞溶液。寻找确认注射成功的小气泡（图2I）。
16. 小心地将胰腺放回腹部，不要干扰肿瘤细胞注射气泡（图2J）。
17. 使用可吸收的5-0聚二恶烷酮缝合线，首先闭合肌肉层，然后用间断缝合线闭合皮肤（图2K-N）。
18. 用氰基丙烯酸酯胶覆盖切口（图2O），然后将鼠标放回加热灯下的干净笼子中进行恢复。在饮用水中使用抗生素以预防感染。监测小鼠并让它们从手术中完全恢复。
    注意:抗生素按照 IACUC 方案的要求给药。所有动物都是单独饲养的。
19. 让肿瘤发展 10-14 天，直到可以通过腹壁触及。

4. 胰腺窗手术

1. 当动物准备好进行成像时，开始窗户植入手术。首先，用消毒肥皂洗手。
2. 每次新手术前，请戴上新的无菌手套。
3. 在加热的手术架上，将鼠标置于右侧卧位，露出左腹部。
4. 使用纸胶带将小鼠的前肢和后肢固定在加热的手术台的颅骨和尾部。确保脾脏（皮下）在手术区域内可见（图3A）。
5. 为保持无菌，请打开引擎盖中的所有手术器械。
6. 通过用大量防腐剂擦拭小鼠的皮肤来对手术部位进行消毒。
7. 通过进行脚趾捏合测试确保动物完全麻醉。
8. 关键步骤:用镊子抬起腹部左上象限的皮肤，并使用Castroviejo剪刀在皮肤和肌肉组织上做一个~10毫米的圆形切口（图3B，C）。
9. 必要时使用棉签或烧灼笔控制出血并维持止血。
10. 定位附着在脾脏上的胰腺，并确定胰腺在切口内的位置，以决定支撑十字绣的放置位置。
11. 使用 5-0 丝线，将第一针放在肌肉层的所需位置。用 3-5 节打结。（图3D，E）
12. 继续直接缝合切口。剪下并留下~5厘米的尾巴（图3F）。
13. 重复步骤4.11和4.12，垂直于第一针（图3G，H）。
14. 关键步骤:轻轻抬起胰腺并将其放置在十字绣上（图3I，J）。注意不要在操作过程中损坏胰腺。
15. 关键步骤:使用 5-0 真丝缝合线，在距离孔 ~1 毫米处进行荷包绳缝合，圆周方向，交错皮肤和肌肉层（图 3K）。
16. 定位窗框，使圆形切口的边缘位于窗口的凹槽内（图3L）。
17. 通过牢牢系住 5-0 真丝来固定植入的窗户。
18. 将 100 μL 液体氰基丙烯酸酯粘合剂加载到 1 mL 注射器中。
19. 通过施加微妙的压缩空气流~10秒来干燥组织。
20. 用镊子扣住窗框的外边缘，轻轻抬起，以确保胰腺与窗框的下表面分离。
21. 关键步骤:沿着窗户的凹槽分配一层薄薄的液态氰基丙烯酸酯粘合剂（图3M）。确保不要让任何粘合剂沾到胰腺组织上。
22. 使用真空拾取器，提起 5 毫米盖玻片。
23. 小心地将盖玻片放在光学窗框中央的凹槽内。轻轻按压，让氰基丙烯酸酯粘合剂凝固（~25 秒）。
24. 使用镊子将盖玻片与真空拾取器分开。
25. 拧紧十字绣缝合线，将胰腺紧贴盖玻片（图3N，O）。注意:不要将十字绣拧得过紧，因为它会对胰腺造成损伤和缺血。
26. 切开缝合线的末端。
27. 从鼠标上撕下胶带。
28. 关闭异氟烷蒸发器。
29. 将小鼠重新安置到干净的笼子中或直接转移到活体显微镜上。
30. 在窗户手术后单独饲养动物，并监测它们直到完全康复。
31. 然后，如前所述，在双激光多光子显微镜上进行成像 ^22,23,24 对于长时间的成像会话，将鼠标放置在加热室中以保持体温^，并按照 IACUC 标准提供支持液。

5.蔚蓝素治疗胰腺炎的诱导

1. 为了研究胰腺炎的发作，在植入SWIP后用蔚蓝素治疗健康小鼠。确保小鼠禁食14-18小时，并在蔚蓝给药 前随意给予 水。
2. 在100μL无菌1x DPBS中腹膜内注射50μg/ kg蔚蓝素，间隔1小时，最多注射8次。单独向对照小鼠施用等量的1x DPBS，腹膜内注射。
3. 成像后，按照IACUC标准，在第一次注射后24小时通过宫颈脱位处死小鼠。
4. 如前所述在双激光多光子显微镜上进行成像22,23,24。对于长时间的成像过程，将鼠标放在加热的腔室中以保持体温，并按照 IACUC 标准为其提供支持液体。

结果

图 1 改编自 Du 等人 ¹⁵，显示了小鼠胰腺延时 IVI 电影的图像静止图像。在初始沉降期（成像的第一个小时，图1A）内可以观察到一些组织运动。然而，在这个稳定期（>75分钟）之后继续成像，我们观察到横向和轴向稳定性的增加（图1B）。将 SWIP 的稳定性与之前的 AIW 和 PIW 成像窗口进行比较，可以确定所有窗口?...

讨论

这里描述的SWIP协议通过利用十字绣篮技术提供了一种改进的胰腺组织稳定方法。早期的腹部成像窗口 （AIW） 能够对腹部内脏器官进行活体成像 （IVI），但不能充分限制胰腺等软组织的运动。作为回应，Park等人开发了一种胰腺成像窗口（PIW），该窗口包含一个水平金属架子，可以提高胰腺组织的稳定性，同时保持与玻璃盖玻片的接触。虽然这种方法提高了横向稳定性，但它限制了实体胰腺肿瘤?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].