쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

요약

우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.

초록

췌장의 생리학과 병태생리학은 복잡합니다. 췌장염 및 췌장 선암(PDAC)과 같은 췌장 질환은 이환율과 사망률이 높습니다. 생체 내 영상(IVI)은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 조직의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 강력한 기술로, 세포 역학을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 쥐 췌장의 IVI는 장기의 깊은 내장 및 순응적 특성으로 인해 손상과 움직임 인공물이 발생하기 쉽기 때문에 심각한 문제를 안고 있습니다.

여기에 설명된 것은 쥐 P안장(SWIP)의 Intravital 이미징을 위한 Stabilized Window의 이식 과정입니다. SWIP는 건강한 췌장에서 세룰레인에 의해 유발된 급성 췌장염으로 변하는 동안, 그리고 췌장 종양과 같은 악성 상태에서 쥐 췌장의 IVI를 허용합니다. SWIP는 유전적으로 표지된 세포 또는 형광 염료 투여와 함께 단일 세포 및 세포 내 역학(단일 세포 및 집단 이동 포함)을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 여러 날에 걸쳐 동일한 관심 영역의 연속 이미징을 가능하게 합니다.

PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담이기 때문에 종양 세포 이동을 포착하는 능력이 특히 중요합니다. PDAC에서 전이의 생리학적 역학을 이해하는 것은 중요한 미충족 요구이며 환자 예후를 개선하는 데 매우 중요합니다. 전반적으로 SWIP는 향상된 영상 안정성을 제공하고 건강한 췌장 및 악성 췌장 질환에서 IVI의 적용을 확대합니다.

서문

양성 및 악성 췌장 질환은 잠재적으로 생명을 위협할 수 있으며, 병태생리학에 대한 이해에 상당한 격차가 있습니다. 췌장염(췌장 염증)은 미국에서 위장 질환 관련 입원 및 재입원의 세 번째 주요 원인이며 상당한 이환율, 사망률 및 사회경제적 부담과 관련이 있다¹. 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인으로 꼽히는^췌관 선암(PDAC)은 대부분의 췌관 악성 종양3을^{차지하며3} 5년 생존율이 11^%에 불과하다2. PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담입니다. 불행히도 대부분의 환자는 전이성 질환을 가지고 있습니다. 따라서 PDAC에서 전이의 역학을 이해하는 것은 암 연구 분야에서 중요한 미충족 요구입니다.

염증과 췌장의 전이성 연쇄 작용을 뒷받침하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식 격차의 주요 원인은 생체 내에서 췌장 세포 역학을 관찰할 수 없다는 것입니다. 이러한 세포 역학을 직접 관찰하면 췌장 질환 환자의 진단 및 치료를 활용하고 개선할 수 있는 중요한 표적을 밝힐 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 창문의 패시베이션

알림: 스테인리스강의 패시베이션은 금속의 오염 물질을 청소하고 얇은 산화물 층을 생성하여 티타늄¹⁶을 능가하는 연조직과의 금속의 생체 적합성을 크게 증가시킵니다.

1. 광학 창틀을 1%(w/v) 효소 활성 세제 용액으로 세척하여 패시베이션 과정을 시작합니다.
2. 유리병 안에 70°C의 5%(w/v) 수산화나트륨 용액에 프레임을 30분 동안 담그십시오.
3. 프레임을 꺼내 탈이온수로 헹굽니다.
4. 프레임을 55°C의 7%(w/v) 구연산 용액에 새 유리병 안에 10분 동안 담그십시오.
5. 프레임을 제거하고 탈이온수로 다시 헹굽니다.
6. 1.2단계를 반복하고 마지막으로 마지막으로 탈이온수로 창틀을 헹굽니다.

토론

여기에 설명된 SWIP 프로토콜은 십자수 바스켓 기술을 활용하여 췌장 조직 안정화의 개선된 방법을 제공합니다. 초기 복부 영상 창(AIW)은 복부 내부 장기의 생체 내 영상(IVI)을 가능하게 했지만 췌장과 같은 연조직의 움직임을 적절하게 제한하지 못했습니다. 이에 대응하여 Park et al.은 수평 금속 선반을 통합하고 유리 커버슬립과의 접촉을 유지하면서 췌장 조직의 안정화를 개선할 수 있는 췌장 이?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	NA	Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	Passivation reagent
5 mm cover glass	Electron Microscopy Sciences	72296-05	Round Glass Coverslips
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275	Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe	BD	329410	Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp	McMaster-Carr	3349K51	Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors	World Precision Instruments	WP2220	Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution	Durvet	7-45801-10258-3	Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12	Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue	Staples	234790-6	Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue	Staples	LOC1647358	Coverslip Glue
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software	NA	NA	See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R	Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	Heated platform
Nair Hair Removal Lotion	Amazon	B001RVMR7K	Depilatory Lotion
Oxygen	TechAir	OX TM	Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0	VWR	95056-872	Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Heated Platform Controller
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	Vascular Label
Window-fixturing plate	NA	NA	Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame	NA	NA	The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].