A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
يحدد هذا البحث تقنيتين لعزل مصائد العدلات خارج الخلية الوفيرة (NETs) من نخاع عظم الفئران. تجمع إحدى الطرق بين مجموعة عزل العدلات التجارية والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الطرد المركزي المتدرج للكثافة فقط. كلا النهجين يتمخضان عن شبكات وظيفية تفوق تلك الموجودة في العدلات الدموية المحيطية.
كان الهدف الأساسي من هذا البحث هو تطوير نهج موثوق وفعال لعزل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) من نخاع عظم الفئران. نشأ هذا الجهد بسبب القيود المرتبطة بالطريقة التقليدية لاستخراج الشبكات من الدم المحيطي ، ويرجع ذلك أساسا إلى ندرة العدلات المتاحة للعزل. كشفت الدراسة عن منهجيتين متميزتين للحصول على العدلات الفئران من نخاع العظام: إجراء مبسط من خطوة واحدة أسفر عن مستويات تنقية مرضية ، وعملية من خطوتين أكثر كثافة للوقت أظهرت كفاءة تنقية معززة. الأهم من ذلك ، أن كلتا التقنيتين أسفرت عن كمية كبيرة من العدلات القابلة للحياة ، تتراوح بين 50 إلى 100 مليون لكل فئران. عكست هذه الكفاءة النتائج التي تم الحصول عليها من عزل العدلات من كل من المصادر البشرية والفئران. بشكل ملحوظ ، أظهرت العدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران قدرات مماثلة لإفراز الشبكات عند مقارنتها بالعدلات التي تم الحصول عليها من الدم المحيطي. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على نخاع العظم أنتجت باستمرار كميات أكبر بشكل ملحوظ من كل من العدلات و NETs. أظهر هذا النهج إمكانية الحصول على كميات أكبر بكثير من هذه المكونات الخلوية لمزيد من التطبيقات النهائية. والجدير بالذكر أن هذه الشبكات المعزولة والعدلات تبشر بمجموعة من التطبيقات ، تغطي مجالات الالتهاب والعدوى وأمراض المناعة الذاتية.
تشكل العدلات مجموعة فرعية حرجة من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية الفطرية. وهي تتميز بنوى وحبيبات متعددة الفصوص تحتوي على مختلف البروتياز والببتيدات المضادة للميكروبات1. تعمل العدلات بشكل أساسي من خلال التحلل ، البلعمة ، وتشكيل NETs. تم إجراء ملاحظة الشبكات لأول مرة بواسطة Takei et al. في عام 1996 خلال تجربة حيث تم تحفيز العدلات باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA) 2. في وقت لاحق ، تمت صياغة عملية تكوين NET "NETosis" بواسطة Brinkmann et al.3 في عام 2004. سلط بحثهم الضوء على الدور الحاسم لشبكات NETs في استجابات مضادات الميكروبات بوساطة العدلات. الشبكات عبارة عن هياكل تشبه الويب تتكون من الكروماتين والهستونات والبروتينات المضادة للميكروبات التي يتم إطلاقها من العدلات المنشطة استجابة للمحفزات المعدية والالتهابية. يمكن للشبكات شل حركة وقتل مسببات الأمراض الغازية عن طريق محاصرتها وتعريضها لتركيز عال من الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1,3. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم الشبكات في إزالة الخلايا المبرمج والمشاركة في حل الالتهاب. تشير الدراسات الحديثة أيضا إلى أن التكوين المفرط للشبكات أو ضعف تدهور الشبكة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة ، واضطرابات المناعة الذاتية ، وتكوين الجلطات ، وضعف إعادة التوعي4،5،6،7،8،9،10.
تم إثبات الدور الممرض للشبكات في التليف غير المنضبط بعد احتشاء عضلة القلب وتشكيل تمدد الأوعية الدموية البطيني من خلال توسيع التليف حول الأوعية الدموية4،11. نموذج احتشاء عضلة القلب وعزل العدلات من نخاع العظام في الفئران كلاهما راسخ. الكريات البيض متعددة الأشكال (PMN) ، وهي نوع من خلايا الدم البيضاء الوفيرة في دم الإنسان ، بمثابة مصدر ممتاز لعزل العدلات البشرية. هذه الطريقة تلغي الحاجة إلى حصاد نخاع العظام ، وبالتالي تعزيز السلامة والكفاءة.
تلعب الشبكات أيضا دورا في الرجفان الأذيني المرتبط بإعادة تشكيل القلب. ومع ذلك ، تم استخدام الكبيرة مثل والخنازير لنمذجة الرجفان الأذيني ، حيث تفتقر الفئران إلى الأذين الكبير بما يكفي لإنشاء دورة إعادة الدخول أو نموذج AF ، ما لم يتم هدم أو طرق إشارات محددة أو طردها12. في حين أنه من الممكن إحداث الرجفان الأذيني في الفئران وعزل العدلات من الدم المحيطي للفئران كما هو موضح سابقا ، واجه الباحثون قيدا حيث يمكن عزل 2 × 105-5 × 105 عدلات فقط من الدم المحيطي (10 مل لكل فئران). يتطلب استخراج شبكات كافية في كل نقطة زمنية ما يقرب من 10-25 فأرا (5 × 106 عدلات في المجموع) ، مما يؤدي إلى عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغالبا ما تكون منخفضة الغلة13. في هذا الصدد ، يقدم Li He وزملاؤه استراتيجية موجهة نحو نخاع العظام للحصول على شبكات كافية من الفئران14. في مقالتهم ، يقدمون وصفا شاملا لعزل العدلات من نخاع عظم الفئران ومقارنة قدرات إفراز NET للعدلات الطرفية ونخاع العظم في الفئران. تلبي الطريقتان التوضيحيتان أهدافا تجريبية متميزة ، وكلاهما ينتج عنه كميات كافية من العدلات في نخاع عظم الفئران مع تقليل عدد الفئران المطلوبة. أظهرت طريقة العزل المكونة من خطوتين تنقية فائقة للعدلات ، بينما أثبتت الطريقة المكونة من خطوة واحدة كفاءتها من حيث الوقت مع مستويات تنقية مقبولة. علاوة على ذلك ، قارن الباحثون NETosis وتشكيل NET بين العدلات في نخاع عظم الفئران ونظيراتها المحيطية ، ووجدوا قوة متساوية مع PMN. تساهم هذه النتائج بشكل كبير في الدراسات المتعلقة بالعدلات حول الرجفان الأذيني وتؤكد على أهمية الاختيار المرن لمصادر مختلفة لعزل العدلات في التجارب المختلفة ذات توزيعات العدلات المختلفة.
تم إجراء الدراسة بموجب ترخيص مشروع (رقم 20211404A) ممنوح من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان لرعاية واستخدام. وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية ، تم الحفاظ على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة في بيئة خاضعة للرقابة مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة ، ودرجة حرارة عند 22-24 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪. تم منح الفئران إمكانية الوصول إلى الطعام والماء حسب الطلب. كانت المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور الفئران Sprague Dawley (SD) البالغة من العمر 6-8 أسابيع ، ويزن حوالي 250 جراما وخالية من مسببات الأمراض. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. عزل العدلات الفئران
2. اقتناء شبكات الفئران
3. التحقق من وجود الشبكات
4. التحديد الكمي للشبكات
5. تحليل إفراز الشبكات عن طريق قياس الخلايا الخلوية
يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقتين متميزتين ، تتميز كل منهما بتنقية محسنة أو خطوات مبسطة. أسفرت كلتا الطريقتين عن حوالي 0.5 × 108-1 × 108 عدلات لكل فئران. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي ، باستخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج V-FITC / PI المرفقة ، صلاحية الخلية أعلى من 90٪ ، مقارنة ب?...
يشكل عزل العدلات خطوة محورية في دراسة NETosis ، حيث يكون اختيار طريقة العزل المناسبة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. أحد العوامل المهمة التي يجب وزنها هو حدوث تلوث الخلايا اللمفاوية أثناء العزل. تعتبر معالجة هذا التحدي مهمة بشكل خاص عند عزل عدلات الفئران عن نخاع العظا?...
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام 82004154 و 81900311 و 82100336 و 81970345).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved