Einzigartiger Ansatz zur Isolierung von Neutrophilen im Knochenmark von Ratten mit vergleichbarer Kapazität

Zusammenfassung

Diese Forschung skizziert zwei Techniken zur Isolierung reichlich neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten. Eine Methode kombiniert ein kommerzielles Neutrophilen-Isolationskit mit einer Dichtegradientenzentrifugation, während die andere nur eine Dichtegradientenzentrifugation verwendet. Beide Ansätze liefern funktionelle NETs, die die von peripheren Blutneutrophilen übertreffen.

Zusammenfassung

Das Hauptziel dieser Forschung war es, einen zuverlässigen und effizienten Ansatz zur Isolierung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten zu entwickeln. Diese Bemühungen ergaben sich aus Einschränkungen im Zusammenhang mit der traditionellen Methode zur Extraktion von NETs aus peripherem Blut, hauptsächlich aufgrund des Mangels an verfügbaren Neutrophilen für die Isolierung. Die Studie ergab zwei unterschiedliche Methoden zur Gewinnung von Rattenneutrophilen aus dem Knochenmark: ein optimiertes einstufiges Verfahren, das zufriedenstellende Reinigungswerte ergab, und ein zeitintensiveres zweistufiges Verfahren, das eine verbesserte Reinigungseffizienz aufwies. Wichtig ist, dass beide Techniken eine beträchtliche Menge lebensfähiger Neutrophilen ergaben, die zwischen 50 und 100 Millionen pro Ratte lag. Diese Effizienz spiegelte die Ergebnisse wider, die bei der Isolierung von Neutrophilen sowohl aus menschlichen als auch aus murinen Quellen erzielt wurden. Bezeichnenderweise zeigten Neutrophile aus Rattenknochenmark vergleichbare Fähigkeiten zur Sekretion von NETs im Vergleich zu Neutrophilen, die aus peripherem Blut gewonnen wurden. Die knochenmarkbasierte Methode produzierte jedoch durchweg deutlich größere Mengen sowohl von Neutrophilen als auch von NETs. Dieser Ansatz zeigte das Potenzial, deutlich größere Mengen dieser zellulären Komponenten für weitere nachgelagerte Anwendungen zu gewinnen. Insbesondere diese isolierten NETs und Neutrophilen sind vielversprechend für eine Reihe von Anwendungen, die sich über Entzündungen, Infektionen und Autoimmunerkrankungen erstrecken.

Einleitung

Neutrophile stellen eine kritische Untergruppe von Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunantwort spielen. Sie zeichnen sich durch mehrlappige Kerne und Granula aus, die verschiedene Proteasen und antimikrobielle Peptide enthalten¹. Neutrophile funktionieren hauptsächlich durch Degranulation, Phagozytose und die Bildung von NETs. Die Beobachtung von NETs wurde erstmals 1996 von Takei et al. während eines Experiments durchgeführt, bei dem Neutrophile mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert ^wurden2. In der Folge wurde der Prozess der NET-Bildung 2004 von Brinkmann et ^al.3 als "NETosis" bezeichnet. Ihre Forschung beleuchtete die entscheidende Rolle von NETs bei neutrophilenvermittelten antimikrobiellen Reaktionen. NETs sind netzartige Strukturen, die aus Chromatin, Histonen und antimikrobiellen Proteinen bestehen, die als Reaktion auf infektiöse und entzündliche Reize von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden. NETs können eindringende Krankheitserreger immobilisieren und abtöten, indem sie sie einfangen und einer hohen Konzentration an antimikrobiellen Peptiden und Proteasen aussetzen ^1,3. Darüber hinaus tragen NETs zur Beseitigung apoptotischer Zellen bei und sind an der Auflösung von Entzündungen beteiligt. Neuere Studien deuten auch darauf hin, dass eine übermäßige Bildung von NETs oder ein beeinträchtigter NET-Abbau zu Gewebeschäden, Autoimmunerkrankungen, Thrombogenese und beeinträchtigter Revaskularisierung führen kann 4,5,6,7,8,9,10.

Die pathogene Rolle von NETs bei unkontrollierter Fibrose nach Myokardinfarkt und der Bildung ventrikulärer Aneurysmen wurde durch die Ausbreitung der perivaskulären Fibrose nachgewiesen ^4,11. Das Myokardinfarktmodell und die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark bei Mäusen sind beide gut etabliert. Polymorphkernige (PMN) Leukozyten, eine Art weißer Blutkörperchen, die im menschlichen Blut reichlich vorhanden sind, dienen als hervorragende Quelle für die Isolierung menschlicher Neutrophile. Diese Methode macht die Entnahme von Knochenmark überflüssig und erhöht so die Sicherheit und Effizienz.

NETs spielen auch eine Rolle bei Vorhofflimmern im Zusammenhang mit dem kardialen Umbau. Große Tiere wie Hunde und Schweine wurden jedoch verwendet, um Vorhofflimmern zu modellieren, da Mäusen ein Vorhof fehlt, der groß genug ist, um einen Wiedereintrittszyklus oder das AF-Modell zu etablieren, es sei denn, bestimmte Ionenkanäle oder Signalwege werden ausgeschaltet oder ausgeschaltet¹². Während es möglich ist, Vorhofflimmern bei Ratten zu induzieren und Neutrophile aus dem peripheren Blut von Ratten zu isolieren, stießen die Forscher auf eine Einschränkung, bei der nur 2 x 10^5-5 x 10⁵ Neutrophile aus peripherem Blut isoliert werden konnten (10 ml pro Ratte). Die Extraktion ausreichender NETs zu jedem Zeitpunkt erforderte etwa 10-25 Ratten (insgesamt 5 x 10⁶ Neutrophile), was zu einem zeitaufwändigen, teuren und oft ertragsarmen Prozess führte¹³. In diesem Zusammenhang stellen Li He und Kollegen eine knochenmarkorientierte Strategie vor, um adäquate NETs von Ratten^{zu erhalten 14}. In ihrem Artikel beschreiben sie umfassend die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Ratten und vergleichen die NET-Sekretionsfähigkeiten von peripheren und Knochenmark-Neutrophilen von Ratten. Die beiden beschriebenen Methoden dienen unterschiedlichen experimentellen Zielen, die beide zu ausreichenden Mengen an Neutrophilen im Knochenmark von Ratten führen und gleichzeitig die Anzahl der erforderlichen Ratten reduzieren. Die zweistufige Isolierungsmethode zeigte eine überlegene Neutrophilenreinigung, während sich die einstufige Methode bei akzeptablen Reinigungswerten als zeiteffizient erwies. Darüber hinaus verglichen die Forscher NETose und NET-Bildung zwischen Rattenknochenmark-Neutrophilen und ihren peripheren Gegenstücken und fanden die gleiche Wirksamkeit wie PMN. Diese Ergebnisse tragen wesentlich zu neutrophilenbezogenen Studien zu Vorhofflimmern bei und unterstreichen die Bedeutung der flexiblen Auswahl verschiedener Quellen für die Neutrophilenisolierung bei verschiedenen Versuchstieren mit unterschiedlichen Neutrophilenverteilungen.

Protokoll

Die Studie wurde im Rahmen einer Projektlizenz (Nr. 20211404A) durchgeführt, die vom Tierethikkomitee des West China Hospital, Sichuan University, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Ethics Committee des West China Hospital, Sichuan University, für die Pflege und Verwendung von Tieren erteilt wurde. In Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien wurden die in dieser Studie verwendeten Ratten in einer kontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, einer Temperatur von 22-24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50%-60% gehalten. Die Ratten erhielten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Bei den in dieser Studie verwendeten Tieren handelte es sich um 6-8 Wochen alte männliche Ratten von Sprague Dawley (SD), die etwa 250 g wogen und frei von spezifischen Krankheitserregern waren. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Isolierung von Ratten-Neutrophilen

1. Knochenmarkentnahme
   1. Legen Sie die Ratte zur Anästhesie in einen geeigneten Behälter (siehe Materialtabelle). Verabreichen Sie der Ratte 3% Isofluran, bis das Tier bewusstlos ist. Überprüfen Sie, ob auf ein Zehen- oder Schwanzklemmen nicht reagiert wird, um die Tiefe der Anästhesie sicherzustellen.
   2. Sobald die Ratte tief betäubt ist, führen Sie eine Zervixluxation durch, indem Sie die Ratte auf den Rücken legen und ihren Schwanz mit einer Hand halten, während Sie mit der anderen Hand den Kopf greifen. Verrenken Sie den Hals schnell und fest, indem Sie eine plötzliche und starke Aufwärtskraft auf den Schwanz ausüben und den Kopf nach unten ziehen, bis die Halswirbelsäule durchtrennt ist. Warten Sie auf die Bestätigung des Todes, wie z. B. Atemstillstand und fehlender Herzschlag, bevor Sie mit der Gewebeentnahme oder -entsorgung fortfahren.
   3. Tauchen Sie die Ratte in 75% Ethanol und lassen Sie sie einige Minuten ruhen, um das Fell und die Haut zu sterilisieren. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und trennen Sie die unteren Gliedmaßen an der Hüfte ab, um den Oberschenkelkopf zu schützen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um das Band am Sprunggelenk zu durchtrennen, und klappen Sie das Kniegelenk nach hinten, um den Oberschenkelknochen und das Schienbein freizulegen.
   4. Entfernen Sie mit Pinzetten und Scheren vorsichtig alle Muskeln, Sehnen und anderes Gewebe, das mit den Knochen verbunden ist. Spülen Sie die Knochen mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ab, um verbleibende Gewebereste und Blut zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal, für insgesamt drei Wäschen. Legen Sie die gereinigten Knochen in einen sterilen Behälter.
   5. Verwenden Sie eine 5- oder 10-ml-Spritze mit einer Nadel, um das Knochenmark durch beide Enden des Knochens zu stechen, um die Markmatrix zu lösen. Spülen Sie das Knochenmark mit 10-15 ml Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mit einer anderen Spritze aus, bis kein sichtbares Knochenmark mehr ausgespült werden kann.
   6. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 300 x g für 10 min bei 20 °C. Fügen Sie 5-10 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu (siehe Materialtabelle), um die Zellen zu resuspendieren, und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie der Mischung das 4-fache Volumen von HBSS hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 x g für 5 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und verwenden Sie das resultierende Pellet zur weiteren Verwendung.
2. Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark
   1. Führen Sie für die zweistufige Methode die folgenden zusätzlichen Schritte aus:
      1. Isolieren Sie Knochenmarkzellen mit dem kommerzialisierten Ratten-Neutrophilen-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
      2. Bereiten Sie einen Dichtegradienten vor, indem Sie 2 ml 55 % Percoll-Reagenz (siehe Materialtabelle), 2 ml 65 % des Reagenzes, 2 ml 70 % Reagenz und 2 ml 80 % Reagenz in ein neues 15 ml-Zentrifugenröhrchen schichten. Das Röhrchen wird bei 800 x g für 40 min bei 20 °C zentrifugiert, wobei die Beschleunigung auf 5 und die Verzögerung auf 0 oder 1 eingestellt ist.
      3. Entnehmen Sie die 70%ige Gradientenschicht, einschließlich der Zellschichten an der Grenze zwischen 65%- und 70%igem Gradientenreagenz, mit einer sterilen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 15 ml HBSS in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
   2. Führen Sie für die einstufige Methode die folgenden zusätzlichen Schritte aus:
      1. Setzen Sie Knochenmarkzellen den Gradienten aus, ohne das Ratten-Neutrophilen-Isolationskit zu verwenden.
      2. Sammeln Sie die 70%ige Gradientenschicht, einschließlich der Zellschichten an der Grenze zwischen 65% und 70% Gradient, mit einer sterilen Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Zellen mit HBSS. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
      3. Zählen Sie die isolierten Neutrophilen mit einem Hämozytometer und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Färbung.
         HINWEIS: Das Protokoll kann je nach Anzahl der Ratten und der gewünschten Anzahl isolierter Neutrophiler geändert werden. Eine akzeptable Menge an Knochen wird von drei Ratten erhalten, wenn diese Methode zum ersten Mal in einer neuen Versuchsumgebung angewendet wird. Alle Eingriffe sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark sollte so schnell wie möglich erfolgen, um Zellschäden und den Verlust der Lebensfähigkeit zu minimieren.

2. Erwerb von Ratten-NETs

1. Resuspendieren Sie 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ isolierte Neutrophile in 4 ml RPMI-Medien (ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin) in einer sterilen 10-cm-Petrischale.
2. Fügen Sie der neutrophilen Suspension 500 nM PMA (siehe Materialtabelle) hinzu, um NETose zu induzieren. 3 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
3. Für die Negativkontrolle wird DNase I (10 U/ml) in die neutrophile Suspension gegeben, um die sezernierten NETs abzubauen.
4. Um die NETs zu ernten, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die an der Petrischale befestigten NETs vorsichtig mit HBSS. Verwenden Sie dann eine intensive Spülung mit 4 ml frischem Medium für jede Platte, um die NETs von der Platte zu lösen.
5. Sammeln Sie das Waschmedium und pipettieren Sie häufig, um die NETs vollständig zu resuspendieren.
6. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 20 °C zentrifugiert, um alle schwimmenden Zellen zu entfernen.
7. Die Suspension mit den NETs wird in ein steriles Röhrchen überführt und zur weiteren Verwendung innerhalb von 2 Wochen bei −20 °C gelagert.
   HINWEIS: NETs reagieren empfindlich auf Abbau, daher wird empfohlen, frisch geerntetes Material zu verwenden, um beste Ergebnisse zu erzielen.

3. Überprüfung des Vorhandenseins von NETs

1. Die Zellen (aus Schritt 2.4) 15 min lang mit 4% Paraformaldehyd und 30 min bis 1 h mit Netzen (ab Schritt 2.7) auf Deckgläsern fixieren.
2. Drehen Sie das Deckglas auf einem mit Paraffinfolie bedeckten Reagenzglasständer auf ein PBS/PBST-Tröpfchen und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal für jeweils 5 Minuten.
3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% Triton-X-100 für 10 min bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dreimal in PBS/PBST für jeweils 1 min. Verschließen Sie die Zellen mit dem 10% normalen Eselserum (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
4. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Anti-Ratten-Antikörper gegen neutrophile Elastase und dem Anti-Ratten-Myeloperoxidase-Antikörper (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie dann das Deckglas dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS/PBST.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Sekundärantikörper A488-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), A594-konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgG (H + L) und A594-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG1 (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 h im Dunkeln. Waschen Sie dann das Deckglas dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS/PBST.
6. Färben Sie Zellkerne und NET-Skelette mit 10 mg/ml DAPI. Waschen Sie dann das Deckglas dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS/PBST.
7. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums auf einen Objektträger und drehen Sie das Deckglas mit den Zellen darauf um. Für die mikroskopische Analyse mit Tauchlinsen 1 Stunde trocknen lassen; Andernfalls ist es zur Inspektion bereit.
   HINWEIS: Bei der Manipulation von Netzen ist auch nach der Fixierung große Vorsicht geboten, da sie extrem zerbrechlich sind und bei der Vorbereitung leicht verloren gehen können.

4. Quantifizierung von NETs

1. Bereiten Sie Tris-EDTA (TE)-Puffer und PicoGreen (dsDNA-Assay-Reagenz) Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie Standards vor, indem Sie Stamm-DNA auf Konzentrationen von 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1 μg/ml verdünnen.
   HINWEIS: Zur Quantifizierung der Konzentration von NETs wurde das dsDNA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Richtlinien des Herstellers verwendet. Tris-EDTA (TE)-Puffer und dsDNA-Assay-Reagenzien wurden mit einem 19-fachen Volumen doppelt destilliertem Wasser bzw. einem 199-fachen Volumen TE-Puffer hergestellt. Anschließend wurden Standardlösungen (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1 μg/ml) hergestellt, und jede 50 μl der Probe wurde mit 450 μl TE-Puffer kombiniert.
3. 50 μl jeder Probe in 450 μl TE-Puffer geben.
4. Geben Sie 100 μl Standards oder Proben zusammen mit einem gleichen Volumen der Assay-Reagenz-Arbeitslösung in jede Vertiefung in einer 96-Well-Platte, einschließlich Standards und Proben.
5. Inkubieren Sie die Platte 2-5 Minuten lang bei Raumtemperatur und vermeiden Sie direktes Licht.
6. Lesen Sie die Proben mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader mit einem Emissionsspektrum von etwa 530 nm und einem Absorptionsspektrum von etwa 480 nm.
7. Berechnen Sie die Konzentration von NETs in jeder Probe anhand der von den Standards generierten Standardkurve.

5. Analyse der NETs-Sekretion durch Zellzytometrie

1. Fügen Sie den in der 96-Well-Platte inkubierten Zellen eine Kernfärbung (siehe Materialtabelle) hinzu, um eine Endkonzentration von 10 ng/ml zu erreichen, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.
2. Geben Sie den Zellen eine zellfreie DNA-Färbung (cfDNA, siehe Materialtabelle), um eine Endkonzentration von 300 nM zu erreichen, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.
3. Mischen Sie die Fluoreszenzfarbstoffe durch vorsichtiges Pipettieren. Entsorgen Sie den Überstand nicht und waschen Sie das Pellet nicht.
4. Legen Sie die Probenplatte in das Zytometergerät ein.
5. Stellen Sie die Parameter für Fokus und Belichtungszeit für die verschiedenen Kanäle ein: blau (z. B. 377/50 nm, em: 470/22 nm), normalerweise mit einer Belichtung von 30.000 ms, grün (z. B. 483/32 nm, eM: 536/40 nm) normalerweise mit einer Belichtung von 5.000 ms.
6. Nehmen Sie sehr gleichmäßige Bilder der gesamten Platte auf verschiedenen Kanälen auf.
7. Analysieren Sie die Anzahl der Kernfärbungen für verschiedene Gruppen. Wenn sie ähnlich sind, kann die NETs-Sekretion durch die cfDNA-Färbezahl bestimmt werden.

Ergebnisse

Das hierin beschriebene Protokoll beschreibt zwei verschiedene Methoden, die jeweils durch eine verbesserte Reinigung oder optimierte Schritte gekennzeichnet sind. Beide Methoden ergaben ungefähr 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ Neutrophile pro Ratte. Die Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung des Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Detektionskits zeigte eine Zellviabilität von über 90 %, vergleichbar mit Maus- und menschlichen Gegenstücken (Abbildung 1). Während eine Lymphozytenko...

Diskussion

Die Isolierung von Neutrophilen stellt einen entscheidenden Schritt bei der Untersuchung der NETose dar, bei dem die Auswahl einer geeigneten Isolationsmethode von größter Bedeutung ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Ein wichtiger Faktor, den es abzuwägen gilt, ist das Auftreten einer Lymphozytenkontamination während der Isolierung. Die Bewältigung dieser Herausforderung ist besonders wichtig, wenn Rattenneutrophile aus dem Knochenmark isoliert werden. Trotz des ausgeprägten Dichtebereichs von Neutrophil...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100