分离具有相当容量的大鼠骨髓中性粒细胞的独特方法

摘要

这项研究概述了从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的两种技术。一种方法将商用中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心相结合，而另一种方法仅采用密度梯度离心。这两种方法产生的功能性神经内分泌瘤都超过了外周血中性粒细胞。

摘要

这项研究的主要目的是开发一种可靠有效的方法，用于从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外陷阱 （NET）。这种努力是由于与从外周血中提取NET的传统方法相关的局限性而产生的，主要是由于可用于分离的中性粒细胞稀缺。该研究揭示了从骨髓中获取大鼠中性粒细胞的两种不同方法：一种是简化的一步法，可产生令人满意的纯化水平，另一种是更耗时的两步法，其纯化效率更高。重要的是，这两种技术都产生了大量的活中性粒细胞，每只大鼠在5000万到1亿之间。这种效率反映了从人类和小鼠来源分离中性粒细胞所获得的结果。值得注意的是，与从外周血中获得的中性粒细胞相比，来自大鼠骨髓的中性粒细胞表现出相当的分泌NET的能力。然而，基于骨髓的方法始终产生大量中性粒细胞和神经内分泌瘤。这种方法证明了获得更多数量的这些细胞成分用于进一步下游应用的潜力。值得注意的是，这些分离的神经内分泌瘤和中性粒细胞有望用于一系列应用，涵盖炎症、感染和自身免疫性疾病领域。

引言

中性粒细胞是白细胞的一个关键亚群，在先天免疫反应中起着关键作用。它们的特征是含有各种蛋白酶和抗菌肽的多叶细胞核和颗粒¹。中性粒细胞主要通过脱颗粒、吞噬作用和神经内分泌瘤的形成发挥作用。1996 年，Takei 等人在用肉豆蔻酸佛波醇酯 （PMA） ^刺激中性粒细胞的实验中首次观察到了 NET。随后，Brinkmann 等人 ³ 在 2004 年创造了 NET 形成过程“NETosis”。他们的研究进一步阐明了NETs在中性粒细胞介导的抗菌反应中的关键作用。NET是由染色质、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，这些蛋白在感染和炎症刺激下从活化的中性粒细胞中释放出来。NET可以通过捕获入侵的病原体并将其暴露于高浓度的抗菌肽和蛋白酶来固定和杀死入侵的病原体^1,3。此外，神经内分泌瘤有助于细胞凋亡的清除并参与炎症消退。最近的研究还表明，神经内分泌瘤的过度形成或神经内分泌瘤降解受损可导致组织损伤、自身免疫性疾病、血栓形成和血运重建受损4,5,6,7,8,9,10。

研究方案

该研究是在四川大学华西医院动物伦理委员会授予的项目许可（编号20211404A）下进行的，符合四川大学华西医院动物伦理委员会关于动物护理和使用的指南。根据伦理准则，本研究中使用的大鼠保持在受控环境中，光/暗循环为12小时，温度为22-24°C，湿度为50%-60%。老鼠可以随意获得食物和水。本研究中使用的动物是 6-8 周龄的 Sprague Dawley （SD） 雄性大鼠，体重约 250 g，无特定病原体。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1.大鼠中性粒细胞的分离

1. 骨髓采集
   1. 将大鼠置于适当的容器中进行麻醉（见 材料表）。给大鼠施用3%异氟醚，直到动物失去知觉。检查是否对脚趾捏或尾巴捏没有反应，以确保麻醉深度。
   2. 一旦大鼠被深度麻醉，通过将大鼠放在其背上并用一只手握住它的尾巴，同时用另一只手抓住头部来进行颈椎脱位。通过对尾巴施加突然而强大的向上力，同时向下拉动头部，直到颈椎被切断，从而快速而牢固地使颈部脱臼。等待确认死亡，例如停止呼吸和心跳不畅，然后再进行组织收集或处置。
   3. 将大鼠浸入75%乙醇中，静置几分钟，对皮毛和皮肤进行消毒。将大鼠仰卧并切断臀部的下肢以保护股骨头。用解剖剪刀切开膝关节处的韧带，将膝关节向后折叠，露出股骨和胫骨。
   4. 使用镊子和剪刀，小心地去除任何与骨....

讨论

中性粒细胞的分离是研究NETosis的关键步骤，其中选择适当的分离方法对于获得可靠的结果至关重要。需要权衡的一个重要因素是分离过程中淋巴细胞污染的发生。在从骨髓中分离大鼠中性粒细胞时，应对这一挑战尤为重要。尽管中性粒细胞（1.0814-1.0919，峰值为1.0919）与淋巴细胞（1.0337-1.0765，峰值为1.0526）相比具有不同的密度范围，但淋巴细胞污染仍然不可避免。这在一定程度上可以归因于骨髓?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100