Уникальный подход к выделению нейтрофилов костного мозга крыс с сопоставимой емкостью

Резюме

В этом исследовании описаны два метода выделения многочисленных внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) из костного мозга крысы. Один метод сочетает в себе коммерческий набор для выделения нейтрофилов с центрифугированием с градиентом плотности, в то время как другой использует только центрифугирование с градиентом плотности. Оба подхода дают функциональные НВЛ, превосходящие таковые из нейтрофилов периферической крови.

Аннотация

Основной целью данного исследования была разработка надежного и эффективного подхода к выделению нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) из костного мозга крыс. Эта попытка возникла из-за ограничений, связанных с традиционным методом извлечения НВЛ из периферической крови, в основном из-за нехватки доступных нейтрофилов для выделения. Исследование выявило две различные методологии получения нейтрофилов крыс из костного мозга: оптимизированная одноступенчатая процедура, которая давала удовлетворительные уровни очистки, и более трудоемкий двухступенчатый процесс, который демонстрировал повышенную эффективность очистки. Важно отметить, что оба метода дали значительное количество жизнеспособных нейтрофилов, от 50 до 100 миллионов на крысу. Эта эффективность отражала результаты, полученные при выделении нейтрофилов как из человеческих, так и из мышиных источников. Важно отметить, что нейтрофилы, полученные из костного мозга крыс, продемонстрировали сопоставимую способность секретировать НВЛ по сравнению с нейтрофилами, полученными из периферической крови. Тем не менее, метод, основанный на костном мозге, последовательно производил значительно большее количество как нейтрофилов, так и НВЛ. Этот подход продемонстрировал потенциал получения значительно большего количества этих клеточных компонентов для дальнейшего применения. Примечательно, что эти изолированные НВЛ и нейтрофилы имеют перспективы для целого ряда применений, охватывающих области воспаления, инфекций и аутоиммунных заболеваний.

Введение

Нейтрофилы представляют собой важнейшую подгруппу лейкоцитов, которые играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. Они характеризуются многолопастными ядрами и гранулами, содержащими различные протеазы и антимикробные пептиды¹. Нейтрофилы в основном функционируют за счет дегрануляции, фагоцитоза и образования НВЛ. Наблюдение НВЛ было впервые сделано Takei et al. в 1996 году во время эксперимента, в котором нейтрофилы стимулировались ацетатом форболмиристата (PMA)². Впоследствии, в 2004 году, процесс формирования НВЛ был назван Brinkmann et ^al.3 термином «NETosis». Их исследование еще больше пролило свет на решающую роль НВЛ в нейтрофил-опосредованном антимикробном ответе. НВЛ представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из хроматина, гистонов и антимикробных белков, которые высвобождаются из активированных нейтрофилов в ответ на инфекционные и воспалительные стимулы. НВЛ могут обездвиживать и убивать вторгшихся патогенов, захватывая их и подвергая воздействию высокой концентрации антимикробных пептидов и протеаз ^1,3. Кроме того, НВЛ способствуют очищению апоптотических клеток и участвуют в разрешении воспаления. Недавние исследования также показывают, что чрезмерное образование НВЛ или нарушение деградации НВЛ может привести к повреждению тканей, аутоиммунным нарушениям, тромбогенезу и нарушению реваскуляризации 4,5,6,7,8,9,10.

Патогенетическая роль НВЛ при неконтролируемом фиброзе после инфаркта миокарда и формировании желудочковых аневризм была продемонстрирована на примере распространения периваскулярного фиброза ^4,11. Модель инфаркта миокарда и выделение нейтрофилов из костного мозга у мышей хорошо известны. Полиморфноядерные (ПМН) лейкоциты, тип белых кровяных телец, в изобилии присутствующих в крови человека, служат отличным источником для выделения нейтрофилов человека. Этот метод устраняет необходимость забора костного мозга, что повышает безопасность и эффективность.

НВЛ также играют роль в фибрилляции предсердий, связанной с ремоделированием сердца. Тем не менее, крупные животные, такие как собаки и свиньи, использовались для моделирования фибрилляции предсердий, поскольку у мышей отсутствует предсердие, достаточно большое, чтобы установить цикл повторного входа или модель мерцательной аритмии, если только специфические ионные каналы или сигнальные пути не будут сбиты^или нокаутированы. Несмотря на то, что можно индуцировать фибрилляцию предсердий у крыс и изолировать нейтрофилы из периферической крови крыс, как описано ранее, исследователи столкнулись с ограничением, в соответствии с которым из периферической крови можно было выделить только 2 нейтрофила x 10^5-5 x 10⁵ (10 мл на крысу). Для извлечения достаточного количества НВЛ в каждый момент времени требовалось примерно 10-25 крыс (всего 5 x 10⁶ нейтрофилов), что приводило к трудоемкому, дорогостоящему и часто малопродуктивному^{процессу}. В связи с этим Ли Хэ и его коллеги представляют стратегию, ориентированную на костный мозг, для получения адекватных НВЛ у крыс¹⁴. В своей статье они дают всестороннее описание выделения нейтрофилов из костного мозга крыс и сравнивают возможности секреции НВЛ периферических нейтрофилов и нейтрофилов костного мозга крыс. Эти два метода преследуют различные экспериментальные цели, оба приводят к получению достаточного количества нейтрофилов костного мозга крыс при одновременном снижении количества необходимых крыс. Двухступенчатый метод выделения продемонстрировал превосходную очистку нейтрофилов, в то время как одностадийный метод оказался эффективным по времени при приемлемых уровнях очистки. Кроме того, исследователи сравнили образование нетоза и НВЛ между нейтрофилами костного мозга крыс и их периферическими аналогами, обнаружив одинаковую эффективность с PMN. Эти результаты вносят значительный вклад в исследования фибрилляции предсердий, связанные с нейтрофилами, и подчеркивают важность гибкого выбора различных источников для выделения нейтрофилов у различных экспериментальных животных с различным распределением нейтрофилов.

протокол

Исследование проводилось в соответствии с лицензией на проект (No 20211404A), выданной Комитетом по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета, в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета по уходу за животными и их использованию. В соответствии с этическими принципами, крысы, использованные в этом исследовании, содержались в контролируемой среде с 12-часовым циклом свет/темнота, температурой 22-24 °C и влажностью 50%-60%. Крысам давали доступ к пище и воде вволю. В этом исследовании использовались 6-8-недельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) весом около 250 г и не содержащие специфических патогенов. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Выделение нейтрофилов крыс

1. Забор костного мозга
   1. Поместите крысу в соответствующий контейнер для анестезии (см. Таблицу материалов). Вводите крысе 3% изофлурана до тех пор, пока животное не потеряет сознание. Проверьте отсутствие реакции на защемление пальца ноги или хвоста, чтобы убедиться в глубине анестезии.
   2. После того, как крыса будет глубоко обезболена, выполните вывих шейки матки, положив крысу на спину и держа ее за хвост одной рукой, а другой рукой захватив голову. Быстро и сильно вывихните шею, прикладывая внезапное и сильное усилие вверх к хвосту, одновременно тяну голову вниз до тех пор, пока шейный отдел позвоночника не будет разорван. Дождитесь подтверждения смерти, такого как остановка дыхания и отсутствие сердцебиения, прежде чем приступать к забору или утилизации тканей.
   3. Окуните крысу в 75% этанол и оставьте на несколько минут, чтобы стерилизовать шерсть и кожу. Положите крысу на спину и отрубите нижние конечности в области бедра, чтобы защитить головку бедренной кости. Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать связку в скакательном суставе и отогните коленный сустав назад, чтобы обнажить бедренную и большеберцовую кости.
   4. С помощью щипцов и ножниц осторожно удалите все мышцы, сухожилия и другие ткани, связанные с костями. Промойте кости сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), чтобы удалить остатки тканей и кровь. Повторите еще два раза, в общей сложности три стирки. Очищенные косточки поместите в стерильный контейнер.
   5. Используйте шприц объемом 5 или 10 мл с иглой, чтобы проткнуть костный мозг через оба конца кости, чтобы ослабить матрикс костного мозга. Промойте костный мозг 10-15 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) другим шприцем до тех пор, пока видимый костный мозг не будет вымыт.
   6. Центрифугируют клетки костного мозга при 300 x g в течение 10 мин при 20 °C. Добавьте 5-10 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. таблицу материалов), чтобы ресуспендировать клетки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавьте в смесь в 4 раза больше объема HBSS. Центрифугируют клетки при 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, удаляют надосадочную жидкость пипеткой и используют полученную гранулу для дальнейшего использования.
2. Выделение нейтрофилов из костного мозга
   1. Для двухэтапного метода выполните следующие дополнительные действия:
      1. Изолируйте клетки костного мозга с помощью коммерциализированного набора для выделения нейтрофилов крыс в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
      2. Приготовьте градиент плотности, поместив 2 мл 55%-ного реагента (см. таблицу материалов), 2 мл 65% реагента, 2 мл 70%-ного реагента и 2 мл 80%-ного реагента в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 800 x g в течение 40 мин при 20 °C, при ускорении 5 и замедлении 0 или 1.
      3. Соберите 70%-ный градиентный слой, включая клеточные слои на границе между 65% и 70% градиентным реагентом, с помощью стерильной пипетки. Переложите клеточную суспензию в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 15 мл HBSS в пробирку и осторожно переверните пробирку несколько раз, чтобы промыть клетки. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.
   2. Для одношагового метода выполните следующие дополнительные действия:
      1. Подвергайте клетки костного мозга градиентам без использования набора для выделения нейтрофилов крыс.
      2. Соберите 70%-ный градиентный слой, включая клеточные слои на границе между 65% и 70% градиентом, с помощью стерильной пипетки. Переложите клеточную суспензию в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл и промойте клетки HBSS. Центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки.
      3. Подсчитывают выделенные нейтрофилы с помощью гемоцитометра и оценивают жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть изменен в зависимости от количества крыс и желаемого количества выделенных нейтрофилов. Приемлемое количество костей получено от трех крыс при первом использовании этого метода в новых экспериментальных условиях. Все процедуры должны проводиться в стерильных условиях. Выделение нейтрофилов из костного мозга должно быть выполнено как можно быстрее, чтобы свести к минимуму повреждение клеток и потерю жизнеспособности.

2. Приобретение крысиных сеток

1. Ресуспендант 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ изолированных нейтрофилов в среде RPMI 4 мл (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина) в стерильной чашке Петри 10 см.
2. Добавьте 500 нМ PMA (см. таблицу материалов) к суспензии нейтрофилов, чтобы индуцировать нетоз. Инкубируют в течение 3 ч при 37 °C и 5% CO₂.
3. Для отрицательного контроля добавляют ДНКазу I (10 Ед/мл) в суспензию нейтрофилов для деградации секретируемых НВЛ.
4. Чтобы собрать НВЛ, удалите фильтрующий материал и аккуратно промойте НВЛ, прикрепленные к чашке Петри, HBSS. Затем используйте интенсивную промывку 4 мл свежей среды для каждой чашки, чтобы отделить НЭО от планшета.
5. Часто собирайте промывное средство и пипетку для полной ресуспенднации NET.
6. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 20 °C, чтобы удалить плавающие клетки.
7. Суспензию, содержащую НВЛ, переложить в стерильную пробирку и хранить при температуре −20 °C для дальнейшего использования в течение 2 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: НЭО чувствительны к разложению, поэтому для достижения наилучших результатов рекомендуется использовать свежесобранный материал.

3. Проверка наличия НЭО

1. Фиксируют клетки (с шага 2.4) на покровных стеклах с 4% параформальдегидом в течение 15 мин и НЭТ (с шага 2.7) в течение 30 мин - 1 ч.
2. Переверните покровный листок на каплю PBS/PBST на подставке для пробирок, покрытую парафиновой пленкой, и повторите процесс промывки трижды по 5 минут каждый.
3. Пермеабилизацию клеток 0,5% Triton-X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре и трижды промыть в PBS/PBST по 1 мин. Запечатайте клетки 10% обычной ослиной сывороткой (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре на 1 час.
4. Инкубируют клетки с антителами к нейтрофильной эластазе к крысам и антителами к миелопероксидазе крыс (см. таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C. Затем постирайте покровный листок в PBS/PBST три раза по 5 минут каждый.
5. Инкубируют клетки со вторичным антителом А488-конъюгированным антикроличьим антикроличьим IgG (H + L), А594-конъюгированным ослиным антимышиным IgG (H + L) и А594-конъюгированным козьим анти-мышиным IgG1 (см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Затем постирайте покровный листок в PBS/PBST три раза по 5 минут каждый.
6. Окрашивание клеточных ядер и скелетов НВЛ с помощью DAPI 10 мг/мл. Затем постирайте покровный листок в PBS/PBST три раза по 5 минут каждый.
7. Капните каплю монтажного носителя на предметное стекло и переверните на него покровное стекло с ячейками. Дайте высохнуть в течение 1 ч для микроскопического анализа с помощью иммерсионных линз; В противном случае он готов к проверке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При манипуляциях с НЭО необходимо соблюдать большую осторожность, даже после фиксации, так как они чрезвычайно хрупкие и могут быть легко потеряны во время приготовления.

4. Количественная оценка НЭО

1. Приготовьте буфер Tris-EDTA (TE) и рабочий раствор PicoGreen (реагент для анализа dsDNA) в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
2. Готовят стандарты, разбавляя исходную ДНК до концентраций 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения концентрации НВЛ был использован набор для анализа дцДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителя. Буферные реагенты для анализа Tris-EDTA (TE) и реагенты для анализа дцДНК были приготовлены с использованием 19-кратного объема двойной дистиллированной воды или 199-кратного объема TE-буфера соответственно. Затем готовили стандартные растворы (1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1 мкг/мл), и каждые 50 мкл образца соединяли с 450 мкл ТЭ-буфера.
3. Добавьте по 50 мкл каждого образца в 450 мкл TE буфера.
4. Добавьте 100 мкл стандартов или образцов вместе с равным объемом рабочего раствора реагента в каждую лунку в 96-луночном планшете, включая стандарты и образцы.
5. Выдерживайте планшет при комнатной температуре 2-5 мин, избегая попадания прямых солнечных лучей.
6. Считывание образцов с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера со спектром излучения около 530 нм и спектром поглощения около 480 нм.
7. Рассчитайте концентрацию НВЛ в каждой пробе, используя стандартную кривую, созданную стандартами.

5. Анализ секреции НВЛ методом клеточной цитометрии

1. Добавьте окрашивание ядра (см. Таблицу материалов) к клеткам, инкубируемым в 96-луночном планшете, до достижения конечной концентрации 10 нг/мл и инкубируйте в течение 30 мин.
2. Добавьте окраску внеклеточной ДНК (cfDNA, см. таблицу материалов) к клеткам до достижения конечной концентрации 300 нМ и инкубируйте в течение 10 минут.
3. Смешайте флуоресцентные красители с помощью осторожного пипетирования. Не выбрасывайте надосадочную жидкость и не промывайте гранулы.
4. Загрузите планшет с образцом в цитометр.
5. Установите параметры фокусировки и времени экспозиции для различных каналов: синий (например: 377/50 нм, em: 470/22 нм), обычно с экспозицией 30 000 мс, зеленый (например: 483/32 нм, eM: 536/40 нм), обычно с экспозицией 5 000 мс.
6. Получение однородных изображений всей пластины по разным каналам.
7. Проанализируйте количество окрашиваний ядер для разных групп. Если они похожи, секрецию НВЛ можно определить по количеству красок cfDNA.

Результаты

Протокол, изложенный в настоящем документе, определяет два различных метода, каждый из которых характеризуется улучшенной очисткой или оптимизированными этапами. Оба метода дали приблизительно 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ нейтрофилов на крысу. Анализ проточной цитометрии с использованием ?...

Обсуждение

Выделение нейтрофилов представляет собой ключевой шаг в изучении нетоза, где выбор соответствующего метода выделения имеет первостепенное значение для получения надежных результатов. Важным фактором, который следует взвесить, является возникновение контаминации лимфоцитов во врем?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100