Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании описаны два метода выделения многочисленных внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) из костного мозга крысы. Один метод сочетает в себе коммерческий набор для выделения нейтрофилов с центрифугированием с градиентом плотности, в то время как другой использует только центрифугирование с градиентом плотности. Оба подхода дают функциональные НВЛ, превосходящие таковые из нейтрофилов периферической крови.

Аннотация

Основной целью данного исследования была разработка надежного и эффективного подхода к выделению нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) из костного мозга крыс. Эта попытка возникла из-за ограничений, связанных с традиционным методом извлечения НВЛ из периферической крови, в основном из-за нехватки доступных нейтрофилов для выделения. Исследование выявило две различные методологии получения нейтрофилов крыс из костного мозга: оптимизированная одноступенчатая процедура, которая давала удовлетворительные уровни очистки, и более трудоемкий двухступенчатый процесс, который демонстрировал повышенную эффективность очистки. Важно отметить, что оба метода дали значительное количество жизнеспособных нейтрофилов, от 50 до 100 миллионов на крысу. Эта эффективность отражала результаты, полученные при выделении нейтрофилов как из человеческих, так и из мышиных источников. Важно отметить, что нейтрофилы, полученные из костного мозга крыс, продемонстрировали сопоставимую способность секретировать НВЛ по сравнению с нейтрофилами, полученными из периферической крови. Тем не менее, метод, основанный на костном мозге, последовательно производил значительно большее количество как нейтрофилов, так и НВЛ. Этот подход продемонстрировал потенциал получения значительно большего количества этих клеточных компонентов для дальнейшего применения. Примечательно, что эти изолированные НВЛ и нейтрофилы имеют перспективы для целого ряда применений, охватывающих области воспаления, инфекций и аутоиммунных заболеваний.

Введение

Нейтрофилы представляют собой важнейшую подгруппу лейкоцитов, которые играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. Они характеризуются многолопастными ядрами и гранулами, содержащими различные протеазы и антимикробные пептиды1. Нейтрофилы в основном функционируют за счет дегрануляции, фагоцитоза и образования НВЛ. Наблюдение НВЛ было впервые сделано Takei et al. в 1996 году во время эксперимента, в котором нейтрофилы стимулировались ацетатом форболмиристата (PMA)2. Впоследствии, в 2004 году, процесс формирования НВЛ был назван Brinkmann et al.3 термином «NETosis». Их исследование еще больше....

протокол

Исследование проводилось в соответствии с лицензией на проект (No 20211404A), выданной Комитетом по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета, в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета по уходу за животными и их использованию. В соответствии с этическими принципами, крысы, использованные в этом исследовании, содержались в контролируемой среде с 12-часовым циклом свет/темнота, температурой 22-24 °C и влажностью 50%-60%. Крысам давали доступ к пище и воде вволю. В этом исследовании использовались 6-8-недельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) весом около 250 г и не со....

Результаты

Протокол, изложенный в настоящем документе, определяет два различных метода, каждый из которых характеризуется улучшенной очисткой или оптимизированными этапами. Оба метода дали приблизительно 0,5 x 108-1 x 108 нейтрофилов на крысу. Анализ проточной цитометрии с использованием ?.......

Обсуждение

Выделение нейтрофилов представляет собой ключевой шаг в изучении нетоза, где выбор соответствующего метода выделения имеет первостепенное значение для получения надежных результатов. Важным фактором, который следует взвесить, является возникновение контаминации лимфоцитов во врем?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

Финансирование: Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (NoNo 82004154, 81900311, 82100336 и 81970345).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)Invitrogen, USAA32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)Invitrogen, USAA32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 Invitrogen, USAA21125
Anti-rat myeloperoxidaseAbcam, Englandab134132
Anti-rat neutrophil elastaseAbcam, Englandab21595
Celigo Image CytometerNexelom, USA200-BFFL-5C
DNase ISigma, USA10104159001
fetal bovine serum (FBS)Gibco, USA10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, USAC14175500BT
HoechstThermofisher, USA33342
IsofluraneRWD, ChinaR510-22-10
MowiolSigma, USA81381
Normal Donkey SerumSolarbio, ChinaSL050
Paraformaldehydebiosharp, ChinaBL539A
Penicillin-streptomycinHyclone, USASV30010
PercollGE, USAP8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, USA P1585
Picogreen dsDNA Assay KitInvitrogen, USAP11496
Rat neutrophil isolation kitSolarbio, ChinaP9200
Red blood cell lysis bufferSolarbio, ChinaR1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediaHyclone, USASH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia MachineRWD, ChinaR500
Sprague Dawley (SD) ratsDashuo, China
SytoxGreenThermofisher, USAS7020
Tris-EDTA (TE) bufferSolarbio, ChinaT1120
Triton-X-100Biofroxx, German1139ML100

Ссылки

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены