Уникальный подход к выделению нейтрофилов костного мозга крыс с сопоставимой емкостью

Резюме

В этом исследовании описаны два метода выделения многочисленных внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) из костного мозга крысы. Один метод сочетает в себе коммерческий набор для выделения нейтрофилов с центрифугированием с градиентом плотности, в то время как другой использует только центрифугирование с градиентом плотности. Оба подхода дают функциональные НВЛ, превосходящие таковые из нейтрофилов периферической крови.

Аннотация

Основной целью данного исследования была разработка надежного и эффективного подхода к выделению нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) из костного мозга крыс. Эта попытка возникла из-за ограничений, связанных с традиционным методом извлечения НВЛ из периферической крови, в основном из-за нехватки доступных нейтрофилов для выделения. Исследование выявило две различные методологии получения нейтрофилов крыс из костного мозга: оптимизированная одноступенчатая процедура, которая давала удовлетворительные уровни очистки, и более трудоемкий двухступенчатый процесс, который демонстрировал повышенную эффективность очистки. Важно отметить, что оба метода дали значительное количество жизнеспособных нейтрофилов, от 50 до 100 миллионов на крысу. Эта эффективность отражала результаты, полученные при выделении нейтрофилов как из человеческих, так и из мышиных источников. Важно отметить, что нейтрофилы, полученные из костного мозга крыс, продемонстрировали сопоставимую способность секретировать НВЛ по сравнению с нейтрофилами, полученными из периферической крови. Тем не менее, метод, основанный на костном мозге, последовательно производил значительно большее количество как нейтрофилов, так и НВЛ. Этот подход продемонстрировал потенциал получения значительно большего количества этих клеточных компонентов для дальнейшего применения. Примечательно, что эти изолированные НВЛ и нейтрофилы имеют перспективы для целого ряда применений, охватывающих области воспаления, инфекций и аутоиммунных заболеваний.

Введение

Нейтрофилы представляют собой важнейшую подгруппу лейкоцитов, которые играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. Они характеризуются многолопастными ядрами и гранулами, содержащими различные протеазы и антимикробные пептиды¹. Нейтрофилы в основном функционируют за счет дегрануляции, фагоцитоза и образования НВЛ. Наблюдение НВЛ было впервые сделано Takei et al. в 1996 году во время эксперимента, в котором нейтрофилы стимулировались ацетатом форболмиристата (PMA)². Впоследствии, в 2004 году, процесс формирования НВЛ был назван Brinkmann et ^al.3 термином «NETosis». Их исследование еще больше....

протокол

Исследование проводилось в соответствии с лицензией на проект (No 20211404A), выданной Комитетом по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета, в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета по уходу за животными и их использованию. В соответствии с этическими принципами, крысы, использованные в этом исследовании, содержались в контролируемой среде с 12-часовым циклом свет/темнота, температурой 22-24 °C и влажностью 50%-60%. Крысам давали доступ к пище и воде вволю. В этом исследовании использовались 6-8-недельные крысы-самцы Sprague Dawley (SD) весом около 250 г и не со....

Результаты

Протокол, изложенный в настоящем документе, определяет два различных метода, каждый из которых характеризуется улучшенной очисткой или оптимизированными этапами. Оба метода дали приблизительно 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ нейтрофилов на крысу. Анализ проточной цитометрии с использованием ?.......

Обсуждение

Выделение нейтрофилов представляет собой ключевой шаг в изучении нетоза, где выбор соответствующего метода выделения имеет первостепенное значение для получения надежных результатов. Важным фактором, который следует взвесить, является возникновение контаминации лимфоцитов во врем?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100