Enfoque único para aislar neutrófilos de médula ósea de rata con capacidad comparable

Resumen

Esta investigación describe dos técnicas para aislar abundantes trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Un método combina un kit comercial de aislamiento de neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad, mientras que el otro emplea solo centrifugación en gradiente de densidad. Ambos enfoques producen TNE funcionales que superan a los de los neutrófilos de sangre periférica.

Resumen

El objetivo principal de esta investigación fue desarrollar un enfoque fiable y eficiente para aislar las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Este esfuerzo surgió debido a las limitaciones asociadas con el método tradicional de extracción de TNE de sangre periférica, principalmente debido a la escasez de neutrófilos disponibles para su aislamiento. El estudio reveló dos metodologías distintas para obtener neutrófilos de rata a partir de la médula ósea: un procedimiento simplificado de un solo paso que produjo niveles de purificación satisfactorios, y un proceso de dos pasos más intensivo en tiempo que exhibió una mayor eficiencia de purificación. Es importante destacar que ambas técnicas produjeron una cantidad sustancial de neutrófilos viables, que oscilaban entre 50 y 100 millones por rata. Esta eficiencia reflejó los resultados obtenidos al aislar neutrófilos de fuentes humanas y murinas. Significativamente, los neutrófilos derivados de la médula ósea de rata exhibieron capacidades comparables para secretar TNE en comparación con los neutrófilos obtenidos de sangre periférica. Sin embargo, el método basado en la médula ósea produjo consistentemente cantidades notablemente mayores tanto de neutrófilos como de TNE. Este enfoque demostró el potencial de obtener cantidades significativamente mayores de estos componentes celulares para aplicaciones posteriores. En particular, estos NET y neutrófilos aislados son prometedores para una variedad de aplicaciones, que abarcan los ámbitos de la inflamación, la infección y las enfermedades autoinmunes.

Introducción

Los neutrófilos constituyen un subconjunto crítico de leucocitos que desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria innata. Se caracterizan por núcleos multilobulados y gránulos que contienen diversas proteasas y péptidos antimicrobianos¹. Los neutrófilos funcionan principalmente a través de la degranulación, la fagocitosis y la formación de NET. La observación de los TNE fue realizada por primera vez por Takei et al. en 1996 durante un experimento en el que se estimularon neutrófilos con acetato de miristato de forbol (PMA)². Posteriormente, el proceso de formación de NET fue acuñado como "NETosis" por Brinkmann et ^al.3 en 2004. Su investigación iluminó aún más el papel crucial de los NET en las respuestas antimicrobianas mediadas por neutrófilos. Los TNE son estructuras en forma de red compuestas de cromatina, histonas y proteínas antimicrobianas que se liberan de los neutrófilos activados en respuesta a estímulos infecciosos e inflamatorios. Los TNE pueden inmovilizar y matar patógenos invasores atrapándolos y exponiéndolos a una alta concentración de péptidos antimicrobianos y proteasas ^1,3. Además, los NET contribuyen a la eliminación de las células apoptóticas y participan en la resolución de la inflamación. Estudios recientes también indican que una formación excesiva de TNE o una degradación deficiente de los TNE puede conducir a daño tisular, trastornos autoinmunes, trombogénesis y alteración de la revascularización 4,5,6,7,8,9,10.

El papel patogénico de los TNE en la fibrosis no controlada después del infarto de miocardio y en la formación de aneurismas ventriculares ha sido demostrado a través de la expansión de la fibrosis perivascular ^4,11. El modelo de infarto de miocardio y el aislamiento de neutrófilos de la médula ósea en ratones están bien establecidos. Los leucocitos polimorfonucleares (PMN), un tipo de glóbulo blanco abundante en la sangre humana, sirven como una excelente fuente para aislar neutrófilos humanos. Este método elimina la necesidad de recolectar médula ósea, lo que mejora la seguridad y la eficiencia.

Los tumores neuroendocrinos también desempeñan un papel en la fibrilación auricular asociada con la remodelación cardíaca. Sin embargo, se utilizaron animales grandes como perros y cerdos para modelar la fibrilación auricular, ya que los ratones carecen de una aurícula lo suficientemente grande como para establecer un ciclo de reentrada o el modelo de FA, a menos que los canales iónicos específicos o las vías de señalización sean derribados o eliminados^. Si bien es posible inducir fibrilación auricular en ratas y aislar neutrófilos de la sangre periférica de ratas como se describió anteriormente, los investigadores encontraron una limitación por la cual solo se podían aislar 2 x 10^5-5 x 10⁵ neutrófilos de la sangre periférica (10 ml por rata). La extracción de suficientes NETs en cada punto de tiempo requirió aproximadamente 10-25 ratas (5 x 10⁶ neutrófilos en total), lo que resultó en un proceso lento, costoso y, a menudo, de bajo rendimiento¹³. En este sentido, Li He y sus colegas presentan una estrategia orientada a la médula ósea para obtener TNE adecuados de ratas¹⁴. En su artículo, proporcionan una descripción completa del aislamiento de neutrófilos de la médula ósea de rata y comparan las capacidades de secreción de NET de los neutrófilos periféricos y de la médula ósea de rata. Los dos métodos descritos se adaptan a objetivos experimentales distintos, y ambos dan como resultado cantidades suficientes de neutrófilos de médula ósea de rata al tiempo que reducen el número de ratas necesarias. El método de aislamiento de dos pasos demostró una purificación superior de los neutrófilos, mientras que el método de un solo paso demostró ser eficiente en el tiempo con niveles de purificación aceptables. Además, los investigadores compararon la formación de NETosis y NET entre los neutrófilos de la médula ósea de rata y sus homólogos periféricos, encontrando la misma potencia que la PMN. Estos hallazgos contribuyen significativamente a los estudios relacionados con los neutrófilos de la fibrilación auricular y subrayan la importancia de seleccionar de manera flexible diferentes fuentes para el aislamiento de neutrófilos en varios animales de experimentación con diferentes distribuciones de neutrófilos.

Protocolo

El estudio se realizó bajo una licencia de proyecto (No. 20211404A) otorgada por el Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, en cumplimiento de las directrices del Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan para el cuidado y uso de animales. De acuerdo con las directrices éticas, las ratas utilizadas en este estudio se mantuvieron en un ambiente controlado con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura a 22-24 °C y humedad del 50%-60%. A las ratas se les dio acceso a comida y agua ad libitum. Los animales utilizados en este estudio fueron ratas macho Sprague Dawley (SD) de 6-8 semanas de edad, con un peso aproximado de 250 g y libres de patógenos específicos. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Aislamiento de neutrófilos de rata

1. Extracción de médula ósea
   1. Coloque a la rata en un recipiente apropiado para la anestesia (ver Tabla de materiales). Administrar isoflurano al 3% a la rata hasta que el animal quede inconsciente. Verifique la ausencia de respuesta a un pellizco en el dedo del pie o en la cola para asegurarse de la profundidad de la anestesia.
   2. Una vez que la rata esté profundamente anestesiada, realice la dislocación cervical colocando a la rata boca arriba y sosteniendo su cola con una mano mientras agarra la cabeza con la otra mano. Disloque el cuello rápida y firmemente aplicando una fuerza ascendente repentina y fuerte sobre la cola mientras tira de la cabeza hacia abajo hasta que se corte la columna cervical. Espere la confirmación de la muerte, como el cese de la respiración y la falta de latidos cardíacos, antes de proceder con la recolección o eliminación de tejidos.
   3. Sumerge la rata en etanol al 75% y déjala reposar durante unos minutos para esterilizar el pelaje y la piel. Coloca a la rata boca arriba y corta las extremidades inferiores a la altura de la cadera para proteger la cabeza del fémur. Use tijeras de disección para cortar el ligamento en la articulación del corvejón y doble la articulación de la rodilla hacia atrás para exponer el fémur y la tibia.
   4. Con fórceps y tijeras, retire con cuidado los músculos, tendones y otros tejidos conectados a los huesos. Enjuague los huesos con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés) para eliminar cualquier resto de restos de tejido y sangre. Repita dos veces más, para un total de tres lavados. Coloque los huesos limpios en un recipiente estéril.
   5. Use una jeringa de 5 o 10 ml con una aguja para introducir la médula a través de ambos extremos del hueso para aflojar la matriz de la médula. Enjuague la médula ósea con 10-15 ml de medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con otra jeringa, hasta que no se pueda eliminar la médula ósea visible.
   6. Centrifugar las células de la médula ósea a 300 x g durante 10 min a 20 °C. Agregue 5-10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (consulte la tabla de materiales) para resuspender las células e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Agregue 4 veces el volumen de HBSS a la mezcla. Centrifugar las células a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante con una pipeta y utilizar el gránulo resultante para su uso posterior.
2. Aislamiento de neutrófilos de la médula ósea
   1. Para el método de dos pasos, realice los siguientes pasos adicionales:
      1. Aísle las células de la médula ósea utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos de rata comercializado siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
      2. Prepare un gradiente de densidad colocando 2 ml de reactivo de percolla al 55 % (consulte la tabla de materiales), 2 ml del 65 % del reactivo, 2 ml de reactivo al 70 % y 2 ml de reactivo al 80 % en un tubo de centrífuga nuevo de 15 ml. Centrifugar el tubo a 800 x g durante 40 min a 20 °C, con la aceleración ajustada a 5 y la desaceleración a 0 o 1.
      3. Recoja la capa de gradiente del 70 %, incluidas las capas celulares en el límite entre el reactivo de gradiente del 65 % y el 70 %, utilizando una pipeta estéril. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 15 ml de HBSS en el tubo e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar las células. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente para granular las células.
   2. Para el método de un solo paso, realice los siguientes pasos adicionales:
      1. Sométase las células de la médula ósea a los gradientes sin utilizar el kit de aislamiento de neutrófilos de rata.
      2. Recoja la capa de gradiente del 70 %, incluidas las capas de células en el límite entre el 65 % y el 70 % de gradiente, utilizando una pipeta estéril. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y lave las celdas con HBSS. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células.
      3. Contar los neutrófilos aislados con un hemocitómetro y evaluar la viabilidad mediante tinción con azul de tripano.
         NOTA: El protocolo puede ser modificado dependiendo del número de ratas y del número deseado de neutrófilos aislados. Se obtiene una cantidad aceptable de huesos de tres ratas cuando este método se utiliza por primera vez en un nuevo entorno experimental. Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles. El aislamiento de los neutrófilos de la médula ósea debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el daño celular y la pérdida de viabilidad.

2. Adquisición de redes electrónicas para ratas

1. Resuspender 0,5 x 10^8-1 x 10^{8 8 neutrófilos} aislados en un medio RPMI de 4 ml (suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina al 1%) en una placa de Petri estéril de 10 cm.
2. Añadir 500 nM de PMA (ver Tabla de Materiales) a la suspensión de neutrófilos para inducir NETosis. Incubar durante 3 h a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Para el control negativo, agregue DNasa I (10 U/mL) en la suspensión de neutrófilos para degradar los NET secretados.
4. Para cosechar los NET, retire el medio y lave suavemente los NET adheridos a la placa de Petri con HBSS. Luego, use un lavado intenso con 4 ml de medios frescos para cada placa para separar los NET de la placa.
5. Recoja el medio de lavado y pipetee con frecuencia para la resuspensión completa de los NET.
6. Centrifugar la suspensión a 300 × g durante 10 min a 20 °C para eliminar las células flotantes.
7. Transfiera la suspensión que contiene los NET a un tubo estéril y guárdela a -20 °C para su uso posterior en un plazo de 2 semanas.
   NOTA: Los NET son sensibles a la degradación, por lo que se recomienda utilizar material recién cosechado para obtener mejores resultados.

3. Verificación de la presencia de redes electrónicas

1. Fijar las celdas (a partir del paso 2.4) en cubreobjetos con paraformaldehído al 4% durante 15 min y NETs (a partir del paso 2.7) durante 30 min a 1 h.
2. Invierta el cubreobjetos sobre una gota de PBS/PBST en un soporte para tubos de ensayo cubierto con película de parafina y repita el proceso de lavado tres veces durante 5 minutos cada una.
3. Permeabilizar las células con Triton-X-100 al 0,5% durante 10 min a temperatura ambiente y lavar tres veces en PBS/PBST durante 1 min cada una. Selle las células con el suero de burro normal al 10% (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 1 hora.
4. Incubar las células con el anticuerpo anti-neutrófilos elastasa de rata y el anticuerpo anti-mieloperoxidasa de rata (ver Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C. A continuación, lave el cubreobjetos en PBS/PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
5. Incubar las células con el anticuerpo secundario A488-conjugado burro anti-conejo IgG (H + L), A594-conjugado burro anti-ratón IgG (H + L) y A594-conjugado cabra anti-Ratón IgG1 (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. A continuación, lave el cubreobjetos en PBS/PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
6. Tiñe los núcleos celulares y los esqueletos NET con 10 mg/mL de DAPI. A continuación, lave el cubreobjetos en PBS/PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
7. Coloque una gota de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio e invierta el cubreobjetos con celdas sobre él. Déjalo secar durante 1 h para análisis microscópico con lentes de inmersión; de lo contrario, está listo para su inspección.
   NOTA: Se debe tener mucho cuidado al manipular los NET, incluso después de la fijación, ya que son extremadamente frágiles y pueden perderse fácilmente durante la preparación.

4. Cuantificación de las NETs

1. Prepare el tampón Tris-EDTA (TE) y la solución de trabajo PicoGreen (reactivo de ensayo dsDNA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Prepare patrones diluyendo el ADN madre a concentraciones de 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL y 1 μg/mL.
   NOTA: Para cuantificar la concentración de NETs, se empleó el kit de ensayo dsDNA (ver Tabla de Materiales), siguiendo las directrices del fabricante. El tampón Tris-EDTA (TE) y los reactivos de ensayo de ADNds se prepararon utilizando un volumen de 19 veces de agua destilada doble o un volumen de 199 veces de tampón TE, respectivamente. Posteriormente, se prepararon soluciones patrón (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL y 1 μg/mL) y se combinaron 50 μL de la muestra con 450 μL de tampón TE.
3. Añadir 50 μL de cada muestra a 450 μL de tampón TE.
4. Agregue 100 μL de patrones o muestras junto con un volumen igual de solución de trabajo de reactivo de ensayo a cada pocillo en una placa de 96 pocillos, incluidos los patrones y las muestras.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2-5 min, evitando la luz directa.
6. Lea las muestras utilizando un lector de microplacas de fluorescencia con un espectro de emisión de unos 530 nm y un espectro de absorbancia de unos 480 nm.
7. Calcule la concentración de NETs en cada muestra utilizando la curva estándar generada por los estándares.

5. Análisis de la secreción de NETs por citometría celular

1. Agregue la tinción del núcleo (ver Tabla de Materiales) a las células incubadas en la placa de 96 pocillos para alcanzar una concentración final de 10 ng/mL e incube durante 30 min.
2. Añadir ADN libre de células (cfDNA, ver Tabla de Materiales) a las células hasta alcanzar una concentración final de 300 nM e incubar durante 10 min.
3. Mezcle los tintes fluorescentes mediante un pipeteo suave. No deseche el sobrenadante ni lave el pellet.
4. Cargue la placa de muestra en el instrumento del citómetro.
5. Ajuste los parámetros de enfoque y tiempo de exposición para los diferentes canales: azul (por ejemplo: 377/50 nm, em: 470/22 nm), normalmente con una exposición de 30.000 ms, verde (por ejemplo: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) normalmente con una exposición de 5.000 ms.
6. Capture imágenes altamente uniformes de toda la placa en diferentes canales.
7. Analice los recuentos de tinción de núcleos para diferentes grupos. Si son similares, la secreción de NETs puede determinarse mediante el recuento de tinciones de ADNcf.

Resultados

El protocolo descrito en este documento describe dos métodos distintos, cada uno caracterizado por una purificación mejorada o pasos simplificados. Ambos métodos produjeron aproximadamente 0,5 x 10^8-1 x 10^{8 neutrófilos} por rata. El análisis de citometría de flujo, empleando el kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC/PI, mostró una viabilidad celular superior al 90%, comparable a la de sus homólogos en ratones y humanos (Figura 1). Si bien la contaminaci...

Discusión

El aislamiento de neutrófilos constituye un paso fundamental en el estudio de la NETosis, donde la selección de un método de aislamiento apropiado es primordial para obtener resultados fiables. Un factor importante a tener en cuenta es la aparición de contaminación linfocitaria durante el aislamiento. Abordar este desafío es particularmente importante cuando se aíslan neutrófilos de rata de la médula ósea. A pesar del claro rango de densidad de neutrófilos (1,0814-1,0919, con un pico en 1,0919) en comparación...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100