Enfoque único para aislar neutrófilos de médula ósea de rata con capacidad comparable

Resumen

Esta investigación describe dos técnicas para aislar abundantes trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Un método combina un kit comercial de aislamiento de neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad, mientras que el otro emplea solo centrifugación en gradiente de densidad. Ambos enfoques producen TNE funcionales que superan a los de los neutrófilos de sangre periférica.

Resumen

El objetivo principal de esta investigación fue desarrollar un enfoque fiable y eficiente para aislar las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Este esfuerzo surgió debido a las limitaciones asociadas con el método tradicional de extracción de TNE de sangre periférica, principalmente debido a la escasez de neutrófilos disponibles para su aislamiento. El estudio reveló dos metodologías distintas para obtener neutrófilos de rata a partir de la médula ósea: un procedimiento simplificado de un solo paso que produjo niveles de purificación satisfactorios, y un proceso de dos pasos más intensivo en tiempo que exhibió una mayor eficiencia de purificación. Es importante destacar que ambas técnicas produjeron una cantidad sustancial de neutrófilos viables, que oscilaban entre 50 y 100 millones por rata. Esta eficiencia reflejó los resultados obtenidos al aislar neutrófilos de fuentes humanas y murinas. Significativamente, los neutrófilos derivados de la médula ósea de rata exhibieron capacidades comparables para secretar TNE en comparación con los neutrófilos obtenidos de sangre periférica. Sin embargo, el método basado en la médula ósea produjo consistentemente cantidades notablemente mayores tanto de neutrófilos como de TNE. Este enfoque demostró el potencial de obtener cantidades significativamente mayores de estos componentes celulares para aplicaciones posteriores. En particular, estos NET y neutrófilos aislados son prometedores para una variedad de aplicaciones, que abarcan los ámbitos de la inflamación, la infección y las enfermedades autoinmunes.

Introducción

Los neutrófilos constituyen un subconjunto crítico de leucocitos que desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria innata. Se caracterizan por núcleos multilobulados y gránulos que contienen diversas proteasas y péptidos antimicrobianos¹. Los neutrófilos funcionan principalmente a través de la degranulación, la fagocitosis y la formación de NET. La observación de los TNE fue realizada por primera vez por Takei et al. en 1996 durante un experimento en el que se estimularon neutrófilos con acetato de miristato de forbol (PMA)². Posteriormente, el proceso de formación de NET fue acuñado como "NETosis" por Brin....

Protocolo

El estudio se realizó bajo una licencia de proyecto (No. 20211404A) otorgada por el Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, en cumplimiento de las directrices del Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan para el cuidado y uso de animales. De acuerdo con las directrices éticas, las ratas utilizadas en este estudio se mantuvieron en un ambiente controlado con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura a 22-24 °C y humedad del 50%-60%. A las ratas se les dio acceso a comida y agua ad libitum. Los animales utilizados en este estudio fueron ratas macho Sprague Dawley (SD) de 6-8 semanas de ....

Discusión

El aislamiento de neutrófilos constituye un paso fundamental en el estudio de la NETosis, donde la selección de un método de aislamiento apropiado es primordial para obtener resultados fiables. Un factor importante a tener en cuenta es la aparición de contaminación linfocitaria durante el aislamiento. Abordar este desafío es particularmente importante cuando se aíslan neutrófilos de rata de la médula ósea. A pesar del claro rango de densidad de neutrófilos (1,0814-1,0919, con un pico en 1,0919) en comparación.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100