Approccio unico per l'isolamento di neutrofili del midollo osseo di ratto con capacità comparabili

Riepilogo

Questa ricerca delinea due tecniche per isolare abbondanti trappole extracellulari neutrofile (NET) dal midollo osseo di ratto. Un metodo combina un kit commerciale di isolamento dei neutrofili con la centrifugazione a gradiente di densità, mentre l'altro impiega solo la centrifugazione a gradiente di densità. Entrambi gli approcci producono NET funzionali che superano quelli dei neutrofili del sangue periferico.

Abstract

L'obiettivo principale di questa ricerca è stato quello di sviluppare un approccio affidabile ed efficiente per isolare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) dal midollo osseo di ratto. Questo sforzo è sorto a causa delle limitazioni associate al metodo tradizionale di estrazione dei NET dal sangue periferico, principalmente a causa della scarsità di neutrofili disponibili per l'isolamento. Lo studio ha rivelato due metodologie distinte per ottenere neutrofili di ratto dal midollo osseo: una procedura semplificata in una sola fase che ha prodotto livelli di purificazione soddisfacenti e un processo in due fasi più dispendioso in termini di tempo che ha mostrato una maggiore efficienza di purificazione. È importante sottolineare che entrambe le tecniche hanno prodotto una notevole quantità di neutrofili vitali, compresa tra 50 e 100 milioni per ratto. Questa efficienza rispecchia i risultati ottenuti isolando neutrofili da fonti sia umane che murine. Significativamente, i neutrofili derivati dal midollo osseo di ratto hanno mostrato capacità comparabili di secernere NET rispetto ai neutrofili ottenuti dal sangue periferico. Tuttavia, il metodo basato sul midollo osseo ha costantemente prodotto quantità notevolmente maggiori sia di neutrofili che di NET. Questo approccio ha dimostrato il potenziale per ottenere quantità significativamente maggiori di questi componenti cellulari per ulteriori applicazioni a valle. In particolare, questi NET isolati e neutrofili sono promettenti per una vasta gamma di applicazioni, che abbracciano i regni dell'infiammazione, dell'infezione e delle malattie autoimmuni.

Introduzione

I neutrofili costituiscono un sottogruppo critico di leucociti che svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata. Sono caratterizzati da nuclei e granuli multilobati contenenti varie proteasi e peptidi antimicrobici¹. I neutrofili funzionano principalmente attraverso la degranulazione, la fagocitosi e la formazione di NET. L'osservazione dei NET è stata fatta per la prima volta da Takei et al. nel 1996 durante un esperimento in cui i neutrofili sono stati stimolati con acetato di miristato di forbolo (PMA)². Successivamente, il processo di formazione di NET è stato coniato "NETosis" da Brinkmann et

Protocollo

Lo studio è stato condotto nell'ambito di una licenza di progetto (n. 20211404A) concessa dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan, in conformità con le linee guida del Comitato Etico degli Animali dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan per la cura e l'uso degli animali. In conformità con le linee guida etiche, i ratti utilizzati in questo studio sono stati mantenuti in un ambiente controllato con un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura a 22-24 °C e umidità del 50%-60%. Ai ratti è stato dato accesso a cibo e acqua ad libitum. Gli animali utilizzati in questo studio erano ratti maschi Sprague Dawley....

Discussione

L'isolamento dei neutrofili costituisce un passo fondamentale nello studio di NETosis, dove la selezione di un metodo di isolamento appropriato è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Un fattore importante da valutare è l'insorgenza di contaminazione linfocitaria durante l'isolamento. Affrontare questa sfida è particolarmente significativo quando si isolano i neutrofili di ratto dal midollo osseo. Nonostante il distinto intervallo di densità dei neutrofili (1,0814-1,0919, con un picco a 1,0919) rispetto ai .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100