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この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
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  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

この研究では、ラットの骨髄から豊富な好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための2つの技術について概説しています。1 つの方法は、市販の好中球分離キットと密度勾配遠心分離を組み合わせたもので、もう 1 つは密度勾配遠心分離のみを採用した方法です。どちらのアプローチも、末梢血好中球由来のNETを凌駕する機能的なNETを生成します。

要約

この研究の主な目的は、ラットの骨髄から好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための信頼性が高く効率的なアプローチを開発することでした。この取り組みは、末梢血からNETを抽出する従来の方法に関連する制限、主に単離に利用できる好中球の不足のために生じました。この研究では、骨髄からラット好中球を得るための2つの異なる方法論が明らかになりました:満足のいく精製レベルをもたらす合理化された1ステップ手順と、精製効率の向上を示すより時間のかかる2ステッププロセス。重要なことは、どちらの技術も、ラットあたり5000万から1億の範囲のかなりの量の生存可能な好中球を産出したことです。この効率は、ヒトとマウスの両方の供給源から好中球を単離して得られた結果を反映しています。重要なことに、ラットの骨髄に由来する好中球は、末梢血から得られた好中球と比較して、NETを分泌する同等の能力を示しました。しかし、骨髄ベースの方法では、好中球とNETの両方が一貫して著しく大量に産生されました。このアプローチは、さらなる下流のアプリケーションのために、これらの細胞成分を大幅に大量に入手できる可能性を示しました。特に、これらの単離されたNETと好中球は、炎症、感染症、自己免疫疾患の領域にまたがるさまざまな用途に有望です。

概要

好中球は、自然免疫応答において極めて重要な役割を果たす白血球の重要なサブセットを構成します。それらは、さまざまなプロテアーゼと抗菌ペプチドを含む多葉核および顆粒によって特徴付けられます1。好中球は、主に脱顆粒、食作用、およびNETの形成によって機能します。NETの観察は、1996年に武井らによって、好中球を酢酸ホルボール(PMA)で刺激する実験で初めて行われました2。その後、NETの形成過程は、2004年にBrinkmannらによって「NETosis」と命名されました3。彼らの研究は、好中球を介した抗菌反応におけるNETの重要な役割をさらに明らかにしました。NETは、クロマチン、ヒストン、抗菌タンパク質で構成されるウェブ状の構造で、感染性および炎症性の刺激に応答して活性化好中球から放出されます。NETは、侵入した病原体を捕捉し、高濃度の抗菌ペプチドやプロテアーゼに曝露させることで、病原体を固定化して死滅させることができます1,3。さらに、NETはアポトーシス細胞のクリアランスに寄与し、炎症の解消に関与します。最近の研究では、NETの過剰な形成またはNET分解の障害は、組織損傷、自己免疫疾患、血栓形成、および血行再建術の障害につながる可能性があることも示されています

プロトコル

この研究は、四川大学華西病院の動物倫理委員会によって付与されたプロジェクトライセンス(第20211404A号)に基づいて実施され、動物のケアと使用に関する四川大学華西病院の動物倫理委員会のガイドラインに準拠しています。倫理的ガイドラインに従って、この研究で使用されたラットは、12時間の明暗サイクル、22〜24°Cの温度、50%〜60%の湿度で制御された環境で維持されました。ネズミは自由に餌と水を与えられた。この研究で使用された動物は、体重約250 gで、特定の病原体を含まない6〜8週齢のSprague Dawley(SD)雄ラットでした。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。

1. ラット好中球の単離

  1. 骨髄採取
    1. ラットを麻酔用の適切な容器に入れます( 材料表を参照)。動物が意識を失うまでラットに3%イソフルランを投与します。つま先のつまみや尾のつまみに対する反応がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。
    2. ラットに深く麻酔をかけたら、ラットを仰向けに寝かせ、片手で尻尾を持ち、もう片方の手で頭部をつかんで子宮頸部脱臼を行います。頸椎が切断されるまで頭を下に引っ張りながら、尾に突然強い上向きの力を加えることにより、首をすばやくしっかりと脱臼させます。呼吸の停止や心拍の不足などの死亡の確認を待ってから、組織の収集ま....

代表的な結果

本明細書で概説するプロトコールは、2つの異なる方法を示しており、それぞれが精製の改善または合理化されたステップを特徴としています。どちらの方法でも、ラットあたり約0.5 x 108-1 x 108 の好中球が得られました。アネキシンV-FITC/PIアポトーシス検出キットを用いたフローサイトメトリー解析では、マウスやヒトと同等の90%以上の細胞生存率を示しました(

ディスカッション

好中球の単離は、NETosisの研究において極めて重要なステップであり、信頼できる結果を得るためには、適切な単離方法の選択が最も重要です。重み付けする重要な要素は、単離中のリンパ球汚染の発生です。この課題に対処することは、ラットの好中球を骨髄から単離する場合に特に重要です。リンパ球(1.0337-1.0765、ピーク1.0526)と比較して好中球の密度範囲(1.0814-1.0919、ピークは1.0919)が異な.......

開示事項

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

資金提供:この研究は、中国国家自然科学基金会(第82004154号、81900311号、82100336号、81970345号)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)Invitrogen, USAA32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)Invitrogen, USAA32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 Invitrogen, USAA21125
Anti-rat myeloperoxidaseAbcam, Englandab134132
Anti-rat neutrophil elastaseAbcam, Englandab21595
Celigo Image CytometerNexelom, USA200-BFFL-5C
DNase ISigma, USA10104159001
fetal bovine serum (FBS)Gibco, USA10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, USAC14175500BT
HoechstThermofisher, USA33342
IsofluraneRWD, ChinaR510-22-10
MowiolSigma, USA81381
Normal Donkey SerumSolarbio, ChinaSL050
Paraformaldehydebiosharp, ChinaBL539A
Penicillin-streptomycinHyclone, USASV30010
PercollGE, USAP8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, USA P1585
Picogreen dsDNA Assay KitInvitrogen, USAP11496
Rat neutrophil isolation kitSolarbio, ChinaP9200
Red blood cell lysis bufferSolarbio, ChinaR1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediaHyclone, USASH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia MachineRWD, ChinaR500
Sprague Dawley (SD) ratsDashuo, China
SytoxGreenThermofisher, USAS7020
Tris-EDTA (TE) bufferSolarbio, ChinaT1120
Triton-X-100Biofroxx, German1139ML100

参考文献

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.

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