同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ

要約

この研究では、ラットの骨髄から豊富な好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための2つの技術について概説しています。1 つの方法は、市販の好中球分離キットと密度勾配遠心分離を組み合わせたもので、もう 1 つは密度勾配遠心分離のみを採用した方法です。どちらのアプローチも、末梢血好中球由来のNETを凌駕する機能的なNETを生成します。

要約

この研究の主な目的は、ラットの骨髄から好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための信頼性が高く効率的なアプローチを開発することでした。この取り組みは、末梢血からNETを抽出する従来の方法に関連する制限、主に単離に利用できる好中球の不足のために生じました。この研究では、骨髄からラット好中球を得るための2つの異なる方法論が明らかになりました:満足のいく精製レベルをもたらす合理化された1ステップ手順と、精製効率の向上を示すより時間のかかる2ステッププロセス。重要なことは、どちらの技術も、ラットあたり5000万から1億の範囲のかなりの量の生存可能な好中球を産出したことです。この効率は、ヒトとマウスの両方の供給源から好中球を単離して得られた結果を反映しています。重要なことに、ラットの骨髄に由来する好中球は、末梢血から得られた好中球と比較して、NETを分泌する同等の能力を示しました。しかし、骨髄ベースの方法では、好中球とNETの両方が一貫して著しく大量に産生されました。このアプローチは、さらなる下流のアプリケーションのために、これらの細胞成分を大幅に大量に入手できる可能性を示しました。特に、これらの単離されたNETと好中球は、炎症、感染症、自己免疫疾患の領域にまたがるさまざまな用途に有望です。

概要

好中球は、自然免疫応答において極めて重要な役割を果たす白血球の重要なサブセットを構成します。それらは、さまざまなプロテアーゼと抗菌ペプチドを含む多葉核および顆粒によって特徴^{付けられます1}。好中球は、主に脱顆粒、食作用、およびNETの形成によって機能します。NETの観察は、1996年に武井らによって、好中球を酢酸ホルボール(PMA^)で刺激する実験で初めて行われました2。その後、NETの形成過程は、2004^年にBrinkmannらによって「NETosis」と命名されました3。彼らの研究は、好中球を介した抗菌反応におけるNETの重要な役割をさらに明らかにしました。NETは、クロマチン、ヒストン、抗菌タンパク質で構成されるウェブ状の構造で、感染性および炎症性の刺激に応答して活性化好中球から放出されます。NETは、侵入した病原体を捕捉し、高濃度の抗菌ペプチドやプロテアーゼに曝露させることで、病原体を固定化して死滅させることができます^1,3。さらに、NETはアポトーシス細胞のクリアランスに寄与し、炎症の解消に関与します。最近の研究では、NETの過剰な形成またはNET分解の障害は、組織損傷、自己免疫疾患、血栓形成、および血行再建術の障害につながる可能性があることも示されています4,5,6,7,8,9,10。

心筋梗塞後の制御不能な線維症および心室動脈瘤の形成におけるNETの病原性の役割は、血管周囲線維症の拡大を通じて実証されている^4,11。心筋梗塞モデルとマウスの骨髄からの好中球の分離は、どちらも十分に確立されています。ヒトの血液に豊富に存在する白血球の一種である多形核(PMN)白血球は、ヒト好中球を分離するための優れた供給源として機能します。この方法により、骨髄を採取する必要がなくなるため、安全性と効率が向上します。

NETは、心臓リモデリングに関連する心房細動にも関与しています。しかし、マウスは、特定のイオンチャネルまたはシグナル伝達経路がノックダウンまたはノックアウトされない限り、リエントラントサイクルまたはAFモデルを確立するのに十分な大きさの心房を欠いているため、犬や豚などの大型動物が心房細動のモデル化に利用されました¹²。前述のように、ラットに心房細動を誘発し、ラットの末梢血から好中球を分離することは可能ですが、研究者は、末梢血から2 x 10^5-5 x 10⁵ の好中球しか分離できないという制限に直面しました(ラットあたり10 mL)。各時点で十分なNETを抽出するには、約10〜25匹のラット(合計で5 x 10⁶ の好中球)が必要であり、時間と費用がかかり、しばしば収率の低いプロセスになりました¹³。この点に関して、Li Heらは、ラットから適切なNETを得るための骨髄指向戦略を提示している¹⁴。この論文では、ラットの骨髄から好中球を単離する方法を包括的に説明し、ラットの末梢好中球と骨髄好中球の正味分泌能力を比較しています。概説した2つの方法は、異なる実験目標に対応しており、どちらも十分な量のラット骨髄好中球を得られると同時に、必要なラットの数を減らすことができます。2段階の単離法は優れた好中球精製を示し、1段階の分離法は許容可能な精製レベルで時間効率が良いことが証明されました。さらに、研究者らは、ラットの骨髄好中球とその末梢の対応物との間のNETosisとNET形成を比較し、PMNと同等の効力を発見しました。これらの知見は、心房細動の好中球関連研究に大きく貢献し、好中球分布の異なる様々な実験動物において、好中球分離のための異なる供給源を柔軟に選択することの重要性を強調しています。

プロトコル

この研究は、四川大学華西病院の動物倫理委員会によって付与されたプロジェクトライセンス(第20211404A号)に基づいて実施され、動物のケアと使用に関する四川大学華西病院の動物倫理委員会のガイドラインに準拠しています。倫理的ガイドラインに従って、この研究で使用されたラットは、12時間の明暗サイクル、22〜24°Cの温度、50%〜60%の湿度で制御された環境で維持されました。ネズミは自由に餌と水を与えられた。この研究で使用された動物は、体重約250 gで、特定の病原体を含まない6〜8週齢のSprague Dawley(SD)雄ラットでした。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。

1. ラット好中球の単離

1. 骨髄採取
   1. ラットを麻酔用の適切な容器に入れます( 材料表を参照)。動物が意識を失うまでラットに3%イソフルランを投与します。つま先のつまみや尾のつまみに対する反応がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。
   2. ラットに深く麻酔をかけたら、ラットを仰向けに寝かせ、片手で尻尾を持ち、もう片方の手で頭部をつかんで子宮頸部脱臼を行います。頸椎が切断されるまで頭を下に引っ張りながら、尾に突然強い上向きの力を加えることにより、首をすばやくしっかりと脱臼させます。呼吸の停止や心拍の不足などの死亡の確認を待ってから、組織の収集または廃棄に進みます。.
   3. ラットを75%エタノールに浸し、数分間放置して毛皮と皮膚を殺菌します。ネズミを仰向けに寝かせ、腰で下肢を切断して大腿骨の頭を保護します。解剖ハサミを使用してホックジョイントの靭帯を切断し、膝関節を後方に折りたたんで大腿骨と脛骨を露出させます。
   4. 鉗子とハサミを使用して、骨に接続されている筋肉、腱、その他の組織を慎重に取り除きます。ハンクのバランス塩溶液(HBSS)で骨をすすぎ、残っている組織の破片や血液を取り除きます。さらに2回、合計3回の洗浄を繰り返します。洗浄した骨を滅菌容器に入れます。
   5. 針付きの5mLまたは10mLのシリンジを使用して、骨の両端から骨髄を突き刺し、骨髄マトリックスを緩めます。目に見える骨髄が洗い流されなくなるまで、別の注射器を備えた10〜15 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地で骨髄をすすぎます。.
   6. 骨髄細胞を300 x g で20°Cで10分間遠心分離します。 5〜10 mLの赤血球溶解バッファー( 材料表を参照)を加えて細胞を再懸濁し、室温で3分間インキュベートします。混合物に4倍の容量のHBSSを加えます。細胞を室温で600 x g で5分間遠心分離し、ピペットで上清を廃棄し、得られたペレットをさらに使用するために使用します。
2. 骨髄からの好中球の単離
   1. 2 ステップ方式の場合は、次の追加手順を実行します。
      1. メーカーの指示に従って、市販のラット好中球分離キットを使用して骨髄細胞を単離します( 材料表を参照)。
      2. 新しい 15 mL 遠心チューブに 2 mL の 55% パーコール試薬( 材料表を参照)、2 mL の 65% 試薬、2 mL の 70% 試薬、2 mL の 80% 試薬を重ねて密度勾配を調製します。チューブを800 x g で20°Cで40分間遠心分離し、加速度を5、減速を0または1に設定します。
      3. 滅菌ピペットを使用して、65%と70%のグラジエント試薬の境界にある細胞層を含む70%グラジエント層を回収します。細胞懸濁液を新しい15 mL遠心チューブに移します。15 mL HBSS をチューブに加え、チューブを数回静かに裏返して細胞を洗浄します。チューブを室温で300 x g で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   2. ワンステップ方式の場合は、次の追加手順を実行します。
      1. ラット好中球分離キットを使用せずに骨髄細胞をグラジエントに曝露します。
      2. 滅菌ピペットを使用して、65%と70%のグラジエントの境界にある細胞層を含む70%グラジエント層を回収します。細胞懸濁液を新しい50 mL遠心チューブに移し、HBSSで細胞を洗浄します。チューブを室温で400 x g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
      3. 単離された好中球を血球計算盤でカウントし、トリパンブルー染色で生存率を評価します。
         注:プロトコルは、ラットの数と単離された好中球の所望の数に応じて変更できます。この方法を新しい実験環境で初めて使用したときに、3匹のラットから許容可能な量の骨が得られます。すべての手順は、無菌条件下で実行する必要があります。骨髄からの好中球の単離は、細胞の損傷と生存率の損失を最小限に抑えるために、できるだけ早く実行する必要があります。.

2. ラットNETの獲得

1. 0.5 x 10 8-1 x 10⁸ 単離好中球を 4 mL RPMI 培地(10% ウシ胎児血清 (FBS) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加) に無菌の 10 cm シャーレに再懸濁します。
2. 好中球懸濁液に500 nM PMA( 材料表を参照)を添加して、NETosisを誘導します。37°C、5%_CO2で3時間インキュベートします。
3. ネガティブコントロールでは、DNase I(10 U/mL)を好中球懸濁液に添加して、分泌されたNETを分解します。
4. NETを収穫するには、培地を取り除き、ペトリ皿に付着したNETをHBSSで静かに洗浄します。次に、各プレートに 4 mL の新鮮な培地で強力にフラッシングして、プレートから NET を剥がします。
5. 洗浄剤とピペットを頻繁に回収して、NETを完全に再懸濁してください。
6. 懸濁液を300 × g で20°Cで10分間遠心分離し、浮遊細胞を除去します。
7. NETを含む懸濁液を滅菌チューブに移し、-20°Cで保存し、2週間以内にさらに使用してください。
   注意: NETは劣化に敏感であるため、最良の結果を得るには、収穫したばかりの材料を使用することをお勧めします。

3. NETsの存在の検証

1. 4%パラホルムアルデヒドで15分間、NET(ステップ2.7で)で30分から1時間カバーガラスに細胞(ステップ2.4から)を固定します。
2. パラフィンフィルムで覆われた試験管スタンドのPBS/PBST液滴にカバーガラスを反転させ、洗浄プロセスを5分間ずつ3回繰り返します。
3. 細胞を0.5% Triton-X-100で室温で10分間透過処理し、PBS/PBSTでそれぞれ1分間3回洗浄します。細胞を10%正常ロバ血清( 材料表参照)で室温で1時間密封します。
4. 抗ラット好中球エラスターゼ抗体および抗ラットミエロペルオキシダーゼ抗体( 材料表参照)とともに、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。 次に、カバーガラスをPBS/PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。
5. 二次抗体A488結合ロバ抗ウサギIgG(H + L)、A594結合ロバ抗マウスIgG(H + L)、およびA594結合ヤギ抗マウスIgG1( 材料表参照)とともに、室温で暗所で1時間インキュベートします。次に、カバーガラスをPBS/PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。
6. 細胞核およびNET骨格を10 mg/mL DAPIで染色します。次に、カバーガラスをPBS/PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。
7. スライドガラスに封入剤を一滴垂らし、その上にセルの入ったカバーガラスをひっくり返します。浸漬レンズによる顕微鏡分析のために1時間乾燥させます。それ以外の場合は、検査の準備ができています。
   注:NETは非常に壊れやすく、準備中に簡単に紛失する可能性があるため、固定後でもNETを操作するときは細心の注意を払う必要があります。

4. NETの定量化

1. Tris-EDTA(TE)バッファーとPicoGreen(dsDNAアッセイ試薬)ワーキング溶液は、メーカーの指示に従って調製します( 材料表を参照)。
2. ストック DNA を 1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL の濃度に希釈して標準試料を調製します。
   注:NETの濃度を定量するために、メーカーのガイドラインに準拠したdsDNAアッセイキット( 材料表を参照)を使用しました。Tris-EDTA(TE)バッファーおよび dsDNA アッセイ試薬は、それぞれ 19 倍の容量の 2 蒸留水または 199 倍の容量の TE バッファーを使用して調製しました。続いて、標準溶液(1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL)を調製し、各50 μLのサンプルを450 μLのTE緩衝液と混合しました。
3. 各サンプル 50 μL を 450 μL の TE バッファーに加えます。
4. 100 μL の標準試料またはサンプルと等量のアッセイ試薬ワーキング溶液を、標準試料とサンプルを含む 96 ウェルプレートの各ウェルに加えます。
5. 直射日光を避けながら、プレートを室温で2〜5分間インキュベートします。
6. 発光スペクトルが約 530 nm、吸光度スペクトルが約 480 nm の蛍光マイクロプレートリーダーを使用してサンプルを読み取ります。
7. 標準試料で生成された検量線を使用して、各サンプル中のNETs濃度を計算します。

5. 細胞サイトメトリーによるNETs分泌の解析

1. 96ウェルプレートでインキュベートした細胞に核染色剤( 材料表を参照)を添加し、最終濃度が10 ng/mLになるようにし、30分間インキュベートします。
2. 無細胞DNA(cfDNA、 材料表を参照)染色剤を細胞に添加して最終濃度300 nMにし、10分間インキュベートします。
3. 穏やかなピペッティングで蛍光色素を混合します。上澄みを捨てたり、ペレットを洗ったりしないでください。
4. サンプルプレートをサイトメーター装置にロードします。
5. 青(例:377/50 nm、em:470/22 nm)、通常30,000 msの露光、緑(例:483/32 nm、eM:536/40 nm)、通常5,000 msの露光。
6. 異なるチャンネルでプレート全体の非常に均一な画像を取得します。
7. さまざまなグループの核染色数を分析します。それらが類似している場合、NETsの分泌はcfDNA染色数によって決定できます。

結果

本明細書で概説するプロトコールは、2つの異なる方法を示しており、それぞれが精製の改善または合理化されたステップを特徴としています。どちらの方法でも、ラットあたり約0.5 x 10^8-1 x 10⁸ の好中球が得られました。アネキシンV-FITC/PIアポトーシス検出キットを用いたフローサイトメトリー解析では、マウスやヒトと同等の90%以上の細胞生存率を示しました(

ディスカッション

好中球の単離は、NETosisの研究において極めて重要なステップであり、信頼できる結果を得るためには、適切な単離方法の選択が最も重要です。重み付けする重要な要素は、単離中のリンパ球汚染の発生です。この課題に対処することは、ラットの好中球を骨髄から単離する場合に特に重要です。リンパ球(1.0337-1.0765、ピーク1.0526)と比較して好中球の密度範囲(1.0814-1.0919、ピークは1.0919)が異な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100