גישה ייחודית לבידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה עם קיבולת דומה

Summary

מחקר זה מתאר שתי טכניקות לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בשפע ממח עצם של חולדה. שיטה אחת משלבת ערכת בידוד נויטרופילים מסחרית עם צנטריפוגת שיפוע צפיפות, ואילו השנייה משתמשת רק בצנטריפוגה שיפוע צפיפות. שתי הגישות מניבות NETs פונקציונליים העולים על אלה של נויטרופילים היקפיים בדם.

Abstract

המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לפתח גישה אמינה ויעילה לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) ממח עצם של חולדה. מאמץ זה נבע ממגבלות הקשורות לשיטה המסורתית של חילוץ NETs מדם היקפי, בעיקר בשל המחסור בנויטרופילים זמינים לבידוד. המחקר חשף שתי מתודולוגיות שונות להשגת נויטרופילים של חולדות ממח עצם: הליך יעיל בן שלב אחד שהניב רמות טיהור משביעות רצון, ותהליך דו-שלבי גוזל זמן רב יותר שהציג יעילות טיהור משופרת. חשוב לציין ששתי הטכניקות הניבו כמות משמעותית של נויטרופילים בני קיימא, בטווח שבין 50 ל-100 מיליון לכל חולדה. יעילות זו שיקפה את התוצאות שהתקבלו מבידוד נויטרופילים הן ממקורות אנושיים והן ממקורות מורינים. באופן משמעותי, נויטרופילים שמקורם במח עצם של חולדה הפגינו יכולות דומות להפריש NETs בהשוואה לנויטרופילים שהתקבלו מדם היקפי. עם זאת, השיטה המבוססת על מח עצם ייצרה באופן עקבי כמויות גדולות יותר הן של נויטרופילים והן של NETs. גישה זו הדגימה את הפוטנציאל להשיג כמויות גדולות יותר באופן משמעותי של רכיבים תאיים אלה עבור יישומים נוספים במורד הזרם. יש לציין כי רשתות ונויטרופילים מבודדים אלה טומנים בחובם הבטחה למגוון יישומים, המשתרעים על פני תחומי הדלקת, הזיהום והמחלות האוטואימוניות.

Introduction

נויטרופילים מהווים תת-קבוצה קריטית של לויקוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית המולדת. הם מאופיינים גרעינים מרובי אונות וגרגירים המכילים פרוטאזות שונות ופפטידים מיקרוביאליים¹. נויטרופילים מתפקדים בעיקר באמצעות דה-גרנולציה, פגוציטוזה והיווצרות רשתות חשמל. התצפית של NETs נעשתה לראשונה על ידי Takei et al. בשנת 1996 במהלך ניסוי שבו נויטרופילים היו מגורים עם phorbol myristate אצטט (PMA)². לאחר מכן, תהליך היווצרות הרשת נטבע "NETosis" על ידי Brinkmann et ^al.3 בשנת 2004. המחקר שלהם האיר עוד יותר את התפקיד המכריע של NETs בתגובות מיקרוביאליות בתיווך נויטרופילים. NETs הם מבנים דמויי רשת המורכבים מכרומטין, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים המשתחררים מנויטרופילים פעילים בתגובה לגירויים זיהומיים ודלקתיים. רשתות יכולות לשתק ולהרוג פתוגנים פולשים על ידי לכידתם וחשיפתם לריכוז גבוה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ופרוטאזות ^1,3. בנוסף, NETs תורמים לסילוק תאים אפופטוטיים ומשתתפים ברזולוציית דלקת. מחקרים אחרונים מצביעים גם על כך שהיווצרות מוגזמת של NETs או פגיעה בפירוק הרשת עלולה להוביל לנזק לרקמות, הפרעות אוטואימוניות, טרומבוגנזה ופגיעה ברה-וסקולריזציה 4,5,6,7,8,9,10.

התפקיד הפתוגני של NETs בפיברוזיס בלתי מבוקר לאחר אוטם שריר הלב והיווצרות מפרצות חדריות הוכח באמצעות הרחבת פיברוזיס פריווסקולרי ^4,11. מודל אוטם שריר הלב והבידוד של נויטרופילים ממח עצם בעכברים מבוססים היטב. לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMN), סוג של תאי דם לבנים המצויים בשפע בדם אנושי, משמשים כמקור מצוין לבידוד נויטרופילים אנושיים. שיטה זו מבטלת את הצורך לקצור מח עצם, ובכך משפרת את הבטיחות והיעילות.

NETs גם לשחק תפקיד בפרפור פרוזדורים הקשורים שיפוץ הלב. עם זאת, בעלי חיים גדולים כגון כלבים וחזירים נוצלו כדי למדל פרפור פרוזדורים, מכיוון שלעכברים אין אטריום גדול מספיק כדי ליצור מחזור כניסה מחדש או מודל AF, אלא אם כן תעלות יונים ספציפיות או מסלולי איתות הופלו או הושמדו¹². בעוד שניתן לגרום לפרפור פרוזדורים בחולדות ולבודד נויטרופילים מדם היקפי של חולדות כפי שתואר קודם לכן, החוקרים נתקלו במגבלה לפיה ניתן לבודד רק 2 x 10^{5-5 x} 10 5 נויטרופילים מדם היקפי (10 מ"ל לחולדה). חילוץ מספיק NETs בכל נקודת זמן דרש בערך 10-25 חולדות (5 x 10⁶ נויטרופילים בסך הכל), וכתוצאה מכך תהליך גוזל זמן, יקר, ולעתים קרובות תפוקה נמוכה¹³. בהקשר זה, לי הא ועמיתיו מציגים אסטרטגיה מוכוונת מח עצם להשגת רשתות נאותות מחולדות¹⁴. במאמרם הם מספקים תיאור מקיף של בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה ומשווים את יכולות הפרשת NET של נויטרופילים היקפיים ומח עצם של חולדות. שתי השיטות המתוארות מספקות מטרות ניסוי נפרדות, ושתיהן מביאות לכמויות מספיקות של נויטרופילים ממח עצם של חולדה תוך הפחתת מספר החולדות הדרושות. שיטת הבידוד הדו-שלבי הדגימה טיהור נויטרופילים מעולה, בעוד ששיטת הצעד האחד הוכיחה את עצמה כיעילה בזמן עם רמות טיהור מקובלות. יתר על כן, החוקרים השוו NETosis והיווצרות NET בין נויטרופילים של מח עצם חולדה לבין עמיתיהם ההיקפיים, ומצאו עוצמה שווה עם PMN. ממצאים אלה תורמים באופן משמעותי למחקרים הקשורים לנויטרופילים על פרפור פרוזדורים ומדגישים את החשיבות של בחירה גמישה של מקורות שונים לבידוד נויטרופילים בחיות ניסוי שונות עם התפלגות נויטרופילים שונה.

Protocol

המחקר בוצע תחת רישיון פרויקט (מס '20211404A) שניתן על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן לטיפול ושימוש בבעלי חיים. בהתאם להנחיות אתיות, החולדות ששימשו במחקר זה נשמרו בסביבה מבוקרת עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%. לחולדות ניתנה גישה למזון ומים עד לליביטום. בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו חולדות זכרים בני 6-8 שבועות מסוג Sprague Dawley (SD), במשקל של כ-250 גרם וללא פתוגנים ספציפיים. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. בידוד נויטרופילים של חולדות

1. קצירת מח עצם
   1. הניחו את החולדה במיכל מתאים להרדמה (ראו טבלת חומרים). יש לתת איזופלורן 3% לחולדה עד שהחיה מאבדת את הכרתה. בדוק היעדר תגובה לצביטה בבוהן או צביטת זנב כדי להבטיח את עומק ההרדמה.
   2. לאחר שהחולדה מורדמת עמוק, בצעו נקע צוואר הרחם על ידי הנחת החולדה על גבה והחזקת זנבה ביד אחת תוך אחיזת הראש ביד השנייה. נקע את הצוואר במהירות ובחוזקה על ידי הפעלת כוח פתאומי וחזק כלפי מעלה על הזנב תוך משיכת הראש כלפי מטה עד לקטיעת עמוד השדרה הצווארי. המתן לאישור על מוות, כגון הפסקת נשימה וחוסר דופק, לפני שתמשיך באיסוף רקמות או בסילוקן.
   3. טבלו את החולדה באתנול 75% ותנו לה לשבת כמה דקות כדי לעקר את הפרווה והעור. השכיבו את החולדה על גבה וקטעו את הגפיים התחתונות בירך כדי להגן על ראש עצם הירך. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את הרצועה במפרק ההוק ולקפל את מפרק הברך לאחור כדי לחשוף את עצם הירך והשוקה.
   4. בעזרת מלקחיים ומספריים, הסירו בזהירות את כל השרירים, הגידים ורקמות אחרות המחוברות לעצמות. שטפו את העצמות בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) כדי להסיר את שאריות הרקמות והדם. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות, ובסך הכל שלוש כביסות. הכניסו את העצמות הנקיות למיכל סטרילי.
   5. השתמש מזרק 5 או 10 מ"ל עם מחט כדי לדחוף את המוח דרך שני הקצוות של העצם כדי לשחרר את מטריצת מח. שטפו את מח העצם במדיה של 10-15 מ"ל Roswell Park Memorial Institute (RPMI) עם מזרק אחר, עד שלא ניתן יהיה לשטוף את מח העצם הנראה לעין.
   6. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C. הוסף 5-10 מ"ל חיץ ליזה של תאי דם אדומים (ראה טבלת חומרים) כדי להשהות מחדש את התאים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. מוסיפים פי 4 מנפח HBSS לתערובת. צנטריפוגה את התאים ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, להשליך את supernatant עם פיפטה, ולהשתמש גלולה שנוצר לשימוש נוסף.
2. בידוד נויטרופילים ממח עצם
   1. עבור השיטה הדו-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
      1. בודדו תאי מח עצם באמצעות ערכת בידוד נויטרופילים של חולדות ממוסחרת בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
      2. הכינו שיפוע צפיפות על ידי שכבות 2 מ"ל של מגיב פרקול 55% (ראה טבלת חומרים), 2 מ"ל של 65% מגיב, 2 מ"ל של 70% מגיב, ו -2 מ"ל של 80% מגיב בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 800 x גרם במשך 40 דקות ב 20 ° C, כאשר התאוצה מוגדרת ל 5 וההאטה מוגדרת ל 0 או 1.
      3. אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול שבין 65% ל-70% מגיב מעבר צבע, באמצעות פיפטה סטרילית. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הוסף 15 מ"ל HBSS לתוך הצינור ובעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים.
   2. עבור השיטה החד-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
      1. יש להעביר את תאי מח העצם לשיפועים מבלי להשתמש בערכת בידוד הנויטרופילים של החולדה.
      2. אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול שבין 65% ל-70% מעבר צבע, באמצעות פיפטה סטרילית. העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל ושטפו את התאים עם HBSS. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי pellet את התאים.
      3. ספרו את הנויטרופילים המבודדים באמצעות המוציטומטר והעריכו את הכדאיות באמצעות צביעה כחולה טריפאן.
         הערה: ניתן לשנות את הפרוטוקול בהתאם למספר החולדות ולמספר הרצוי של נויטרופילים מבודדים. כמות מקובלת של עצמות מתקבלת משלוש חולדות כאשר שיטה זו משמשת לראשונה בסביבה ניסיונית חדשה. כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים. בידוד נויטרופילים ממח העצם צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את הנזק לתאים ואת אובדן הכדאיות.

2. רכישת רשתות חולדות

1. יש להשהות מחדש 0.5 x 10^8-1 x 10⁸ נויטרופילים מבודדים במדיית RPMI של 4 מ"ל (בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ.
2. הוסף PMA של 500 ננומטר (ראה טבלת חומרים) לתרחיף הנויטרופילים כדי לגרום ל- NETosis. יש לדגור במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
3. עבור הבקרה השלילית, הוסף DNase I (10 U/mL) לתרחיף הנויטרופילים כדי לפרק את הרשתות המופרשות.
4. כדי לקצור את הרשתות, הסירו את המדיה ושטפו בעדינות את הרשתות המחוברות לצלחת הפטרי עם HBSS. לאחר מכן, השתמשו בשטיפה אינטנסיבית עם 4 מ"ל של מדיה טרייה עבור כל צלחת כדי לנתק את הרשתות מהצלחת.
5. יש לאסוף את מדיום הכביסה והפיפטה לעתים קרובות להשעיה מוחלטת של הרשתות.
6. צנטריפוגה את המתלה ב 300 × גרם למשך 10 דקות ב 20 ° C כדי להסיר תאים צפים.
7. העבירו את המתלה המכיל את ה-NETs לצינור סטרילי ואחסנו בטמפרטורה של -20°C לשימוש נוסף תוך שבועיים.
   הערה: רשתות רגישות להתכלות, ולכן מומלץ להשתמש בחומר שזה עתה נקטף לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

3. אימות נוכחות של NETs

1. תקן את התאים (משלב 2.4) על גבי כיסויים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ו- NETs (משלב 2.7) למשך 30 דקות עד שעה אחת.
2. הפכו את הכיסוי על טיפת PBS/PBST על מעמד מבחנה מכוסה סרט פרפין וחזרו על תהליך הכביסה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
3. יש להחדיר את התאים עם 0.5% Triton-X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף שלוש פעמים ב-PBS/PBST למשך דקה אחת כל אחד. אטמו את התאים עם סרום חמור 10% רגיל (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
4. לדגור על התאים עם נוגדן נויטרופיל אלסטאז נגד חולדה ונוגדן myeloperoxidase נגד חולדה (ראה טבלה של חומרים) במשך הלילה ב 4 ° C. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
5. לדגור על התאים עם נוגדן משני A488-מצומד חמור נגד ארנב IgG (H + L), חמור מצומד A594-anti-mouse IgG (H + L), ו A594-מצומד עז נגד עכבר IgG1 (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה בחושך. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
6. גרעיני תאי צביעה ושלדי נטו עם 10 מ"ג/מ"ל DAPI. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
7. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה על מגלשת זכוכית והפכו את הכיסוי עם תאים עליו. תן לו להתייבש במשך 1 שעה לניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה; אחרת, הוא מוכן לבדיקה.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת מניפולציה של רשתות, גם לאחר קיבוע, מכיוון שהן שבירות ביותר ויכולות בקלות ללכת לאיבוד במהלך ההכנה.

4. כימות רשתות

1. הכן את מאגר Tris-EDTA (TE) ואת פתרון העבודה PicoGreen (מגיב בדיקת dsDNA) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. הכינו תקנים על ידי דילול DNA מלאי לריכוזים של 1 ננוגרם/מ"ל, 10 נ"ג/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל ו-1 מיקרוגרם/מ"ל.
   הערה: כדי לכמת את ריכוז ה-NETs, נעשה שימוש בערכת בדיקת dsDNA (ראה טבלת חומרים), בהתאם להנחיות היצרן. חיץ Tris-EDTA (TE) וריאגנטים לבדיקת dsDNA הוכנו באמצעות נפח של פי 19 של מים מזוקקים כפול או נפח של פי 199 של חיץ TE, בהתאמה. לאחר מכן הוכנו תמיסות סטנדרטיות (1 ננוגרם/מ"ל, 10 נ"ג/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל ו-1 מק"ג/מ"ל), וכל 50 מיקרוליטר מהמדגם שולבו עם 450 מיקרוליטר של חיץ TE.
3. הוסף 50 μL מכל דגימה למאגר TE של 450 μL.
4. הוסף 100 μL של תקנים או דוגמאות יחד עם נפח שווה של פתרון עבודה מגיב בדיקה לכל באר בלוח 96 בארות, כולל תקנים ודגימות.
5. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות, תוך הימנעות מאור ישיר.
6. קרא את הדגימות באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי עם ספקטרום פליטה של כ-530 ננומטר וספקטרום ספיגה של כ-480 ננומטר.
7. חשב את ריכוז ה- NETs בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית הנוצרת על ידי התקנים.

5. ניתוח הפרשת NETs על ידי ציטומטריה של התא

1. הוסיפו כתם גרעין (ראו טבלת חומרים) לתאים המודגרים בצלחת בת 96 הקידוחים כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל ולדגור במשך 30 דקות.
2. הוסיפו לתאים כתם DNA ללא תאים (cfDNA, ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לריכוז סופי של 300 ננומטר ולדגור במשך 10 דקות.
3. מערבבים את הצבעים הפלואורסצנטיים על ידי פיפטינג עדין. אין להשליך את הסופרנאטנט או לשטוף את הכדור.
4. טען את צלחת הדגימה במכשיר הציטומטר.
5. הגדר את הפרמטרים למיקוד ולזמן חשיפה עבור הערוצים השונים: כחול (לדוגמה: 377/50 ננומטר, em: 470/22 ננומטר), בדרך כלל עם חשיפה של 30,000 ננומטר, ירוק (לדוגמה: 483/32 ננומטר, eM: 536/40 ננומטר) בדרך כלל עם חשיפה של 5,000 אלפיות השנייה.
6. צלם תמונות אחידות במיוחד של כל הלוח בערוצים שונים.
7. נתח את ספירת כתמי הגרעין עבור קבוצות שונות. אם הם דומים, הפרשת NETs יכולה להיקבע על ידי ספירת כתמי cfDNA.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שתי שיטות נפרדות, שכל אחת מהן מאופיינת בטיהור משופר או בצעדים יעילים. שתי השיטות הניבו בערך 0.5 x 10^8-1 x 10⁸ נויטרופילים לכל חולדה. ניתוח ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בערכת זיהוי אפופטוזיס ANNEXIN V-FITC/PI, הראה כדאיות תאים מעל 90%, בדומה לעמיתיהם בעכבר ובבני אדם (

Discussion

בידוד הנויטרופילים מהווה צעד מכריע בחקר NETosis, שבו בחירת שיטת בידוד מתאימה היא בעלת חשיבות עליונה להשגת תוצאות אמינות. גורם חשוב לשקול הוא התרחשות של זיהום לימפוציטים במהלך הבידוד. התמודדות עם אתגר זה משמעותית במיוחד כאשר מבודדים נויטרופילים של חולדות ממח העצם. למרות טווח הצפיפות המובהק ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100