גישה ייחודית לבידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה עם קיבולת דומה

Summary

מחקר זה מתאר שתי טכניקות לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בשפע ממח עצם של חולדה. שיטה אחת משלבת ערכת בידוד נויטרופילים מסחרית עם צנטריפוגת שיפוע צפיפות, ואילו השנייה משתמשת רק בצנטריפוגה שיפוע צפיפות. שתי הגישות מניבות NETs פונקציונליים העולים על אלה של נויטרופילים היקפיים בדם.

Abstract

המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לפתח גישה אמינה ויעילה לבידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) ממח עצם של חולדה. מאמץ זה נבע ממגבלות הקשורות לשיטה המסורתית של חילוץ NETs מדם היקפי, בעיקר בשל המחסור בנויטרופילים זמינים לבידוד. המחקר חשף שתי מתודולוגיות שונות להשגת נויטרופילים של חולדות ממח עצם: הליך יעיל בן שלב אחד שהניב רמות טיהור משביעות רצון, ותהליך דו-שלבי גוזל זמן רב יותר שהציג יעילות טיהור משופרת. חשוב לציין ששתי הטכניקות הניבו כמות משמעותית של נויטרופילים בני קיימא, בטווח שבין 50 ל-100 מיליון לכל חולדה. יעילות זו שיקפה את התוצאות שהתקבלו מבידוד נויטרופילים הן ממקורות אנושיים והן ממקורות מורינים. באופן משמעותי, נויטרופילים שמקורם במח עצם של חולדה הפגינו יכולות דומות להפריש NETs בהשוואה לנויטרופילים שהתקבלו מדם היקפי. עם זאת, השיטה המבוססת על מח עצם ייצרה באופן עקבי כמויות גדולות יותר הן של נויטרופילים והן של NETs. גישה זו הדגימה את הפוטנציאל להשיג כמויות גדולות יותר באופן משמעותי של רכיבים תאיים אלה עבור יישומים נוספים במורד הזרם. יש לציין כי רשתות ונויטרופילים מבודדים אלה טומנים בחובם הבטחה למגוון יישומים, המשתרעים על פני תחומי הדלקת, הזיהום והמחלות האוטואימוניות.

Introduction

נויטרופילים מהווים תת-קבוצה קריטית של לויקוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית המולדת. הם מאופיינים גרעינים מרובי אונות וגרגירים המכילים פרוטאזות שונות ופפטידים מיקרוביאליים¹. נויטרופילים מתפקדים בעיקר באמצעות דה-גרנולציה, פגוציטוזה והיווצרות רשתות חשמל. התצפית של NETs נעשתה לראשונה על ידי Takei et al. בשנת 1996 במהלך ניסוי שבו נויטרופילים היו מגורים עם phorbol myristate אצטט (PMA)². לאחר מכן, תהליך היווצרות הרשת נטבע "NETosis" על ידי Brinkmann et ^al.3 בשנת 2004. המחקר שלהם האיר עוד יותר את התפקיד המכריע של NETs בתגובות מיקרוביאליות בתיווך נויטרופילים. NETs הם מבנים דמויי רשת המורכבים מכרומט....

Protocol

המחקר בוצע תחת רישיון פרויקט (מס '20211404A) שניתן על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן לטיפול ושימוש בבעלי חיים. בהתאם להנחיות אתיות, החולדות ששימשו במחקר זה נשמרו בסביבה מבוקרת עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%. לחולדות ניתנה גישה למזון ומים עד לליביטום. בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו חולדות זכרים בני 6-8 שבועות מסוג Sprague Dawley (SD), במשקל של כ-250 גרם וללא פתוגנים ספציפיים. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. בידוד נויטרופילים של חולדות<....

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שתי שיטות נפרדות, שכל אחת מהן מאופיינת בטיהור משופר או בצעדים יעילים. שתי השיטות הניבו בערך 0.5 x 10^8-1 x 10⁸ נויטרופילים לכל חולדה. ניתוח ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בערכת זיהוי אפופטוזיס ANNEXIN V-FITC/PI, הראה כדאיות תאים מעל 90%, בדומה לעמיתיהם בעכבר ובבני אדם (

Discussion

בידוד הנויטרופילים מהווה צעד מכריע בחקר NETosis, שבו בחירת שיטת בידוד מתאימה היא בעלת חשיבות עליונה להשגת תוצאות אמינות. גורם חשוב לשקול הוא התרחשות של זיהום לימפוציטים במהלך הבידוד. התמודדות עם אתגר זה משמעותית במיוחד כאשר מבודדים נויטרופילים של חולדות ממח העצם. למרות טווח הצפיפות המובהק ש?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100