القياس الكمي وتقييم الجدوى واستراتيجيات التصور للأغشية الحيوية الراكدة

Summary

يصف هذا البروتوكول تحضير اللقاح ، والقياس الكمي للغشاء الحيوي على ألواح العيار الدقيق باستخدام صبغة البنفسج البلوري ، والعدد القابل للتطبيق في الأغشية الحيوية ، وتصور الأغشية الحيوية للراكدة.

Abstract

تسبب الراكدة عدوى المستشفيات ويمكن أن يساهم تكوين الأغشية الحيوية في البقاء على الأسطح الجافة مثل بيئات المستشفيات. وبالتالي ، فإن القياس الكمي والأغشية الحيوية والتصور هما طريقتان مهمتان لتقييم إمكانات سلالات الراكدة للتسبب في عدوى المستشفيات. يمكن قياس الأغشية الحيوية المتكونة على سطح الصفيحة الدقيقة من حيث الحجم وأعداد الخلايا. يمكن قياس أحجام الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخها باستخدام البنفسج البلوري ، والغسيل ، وإزالة البقع باستخدام الإيثانول ، ثم قياس الصبغة القابلة للذوبان باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. لتحديد عدد الخلايا المضمنة في الأغشية الحيوية ، يتم التخلص من الأغشية الحيوية باستخدام كاشطات الخلايا ، ويتم حصادها في المياه المالحة ، وتحريكها بقوة في وجود حبات زجاجية ، وتنتشر على أجار Acinetobacter. بعد ذلك ، يتم تحضين الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة. بعد الحضانة ، يتم تعداد المستعمرات الحمراء لتقدير عدد الخلايا في الأغشية الحيوية. يمكن أن تكون طريقة العد القابلة للتطبيق هذه مفيدة أيضا لحساب خلايا Acinetobacter في الأغشية الحيوية المختلطة الأنواع. يمكن تصور الأغشية الحيوية الراكدة باستخدام أصباغ الفلورسنت. يتم استخدام صفيحة مجهرية متاحة تجاريا مصممة للتحليل المجهري لتشكيل الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي بأصباغ SYTO9 و propidium iodide ، وغسلها ، ثم تصورها باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

Introduction

من المعروف أن الراكدة تسبب عدوى المستشفيات ، ويتم الإبلاغ عن عدواها البشرية ، خاصة في مرافق الرعاية الصحية ، بشكل متزايد¹. ينتشر على نطاق واسع في المستشفيات ومرافق الرعاية الصحية والبيئات المرتبطة بالغذاء²،^3،4. يمكن أن يعيش لفترة طويلة في البيئات بما في ذلك أسطح المستشفيات مثل قضبان السرير وطاولات السرير وسطح أجهزة التهوية والأحواض⁴. قد يكون هذا الثبات على الأسطح البيئية أحد العوامل المهمة التي تساهم في عدوى المستشفيات من Acinetobacter⁴.

الأغشية الحيوية هي شكل....

Protocol

1. إعداد اللقاح البكتيري

1. قم بإزالة قارورة مخزون الجلسرين المخزنة في -80 درجة مئوية.
2. قم بإزالة السلالة البكتيرية (2-10 ميكرولتر) من القارورة باستخدام طرف ماصة معقم.
   ملاحظة: تستخدم سلالات الراكدة ، A. bouvetii (13-1-1) ، A. junii (13-1-2) ، A. pittii (13-2-5) ، A. baumannii (13-2-9) ، A. radioresistens (20-1) ، و A. ursingii (24-1) في هذا البروتوكول.
3. تلقيح صفيحة أجار الدم المتاحة تجاريا (أجار الصويا التربتي المكمل ب 5٪ دم غنم ، انظر جدول المواد) بالبكتيريا.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسائط أخرى ، مثل أجار المغذيات أو أجار MacConkey.
<....

النتائج

وفقا للبروتوكول ، تم تشكيل الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter ، المعزولة أصلا من أسطح المطبخ ، على صفيحة من البوليسترين 96 بئرا ، ملطخة بالبنفسج البلوري ، وتم إذابة الأصباغ في الإيثانول وقياسها لكتلة الأغشية الحيوية (الشكل 1). ويختلف عدد الأغشية الحيوية تفاوتا كبيرا تبعا ل?.......

Discussion

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم قياس تكوين الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter بدرجات متفاوتة ، وتصورها ، وتم تقدير الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3).

في هذا البروتوكول ، تم استخدام درجتي ح?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM