A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تحضير اللقاح ، والقياس الكمي للغشاء الحيوي على ألواح العيار الدقيق باستخدام صبغة البنفسج البلوري ، والعدد القابل للتطبيق في الأغشية الحيوية ، وتصور الأغشية الحيوية للراكدة.

Abstract

تسبب الراكدة عدوى المستشفيات ويمكن أن يساهم تكوين الأغشية الحيوية في البقاء على الأسطح الجافة مثل بيئات المستشفيات. وبالتالي ، فإن القياس الكمي والأغشية الحيوية والتصور هما طريقتان مهمتان لتقييم إمكانات سلالات الراكدة للتسبب في عدوى المستشفيات. يمكن قياس الأغشية الحيوية المتكونة على سطح الصفيحة الدقيقة من حيث الحجم وأعداد الخلايا. يمكن قياس أحجام الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخها باستخدام البنفسج البلوري ، والغسيل ، وإزالة البقع باستخدام الإيثانول ، ثم قياس الصبغة القابلة للذوبان باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. لتحديد عدد الخلايا المضمنة في الأغشية الحيوية ، يتم التخلص من الأغشية الحيوية باستخدام كاشطات الخلايا ، ويتم حصادها في المياه المالحة ، وتحريكها بقوة في وجود حبات زجاجية ، وتنتشر على أجار Acinetobacter. بعد ذلك ، يتم تحضين الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة. بعد الحضانة ، يتم تعداد المستعمرات الحمراء لتقدير عدد الخلايا في الأغشية الحيوية. يمكن أن تكون طريقة العد القابلة للتطبيق هذه مفيدة أيضا لحساب خلايا Acinetobacter في الأغشية الحيوية المختلطة الأنواع. يمكن تصور الأغشية الحيوية الراكدة باستخدام أصباغ الفلورسنت. يتم استخدام صفيحة مجهرية متاحة تجاريا مصممة للتحليل المجهري لتشكيل الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي بأصباغ SYTO9 و propidium iodide ، وغسلها ، ثم تصورها باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

Introduction

من المعروف أن الراكدة تسبب عدوى المستشفيات ، ويتم الإبلاغ عن عدواها البشرية ، خاصة في مرافق الرعاية الصحية ، بشكل متزايد1. ينتشر على نطاق واسع في المستشفيات ومرافق الرعاية الصحية والبيئات المرتبطة بالغذاء2،3،4. يمكن أن يعيش لفترة طويلة في البيئات بما في ذلك أسطح المستشفيات مثل قضبان السرير وطاولات السرير وسطح أجهزة التهوية والأحواض4. قد يكون هذا الثبات على الأسطح البيئية أحد العوامل المهمة التي تساهم في عدوى المستشفيات من Acinetobacter4.

الأغشية الحيوية هي شكل....

Protocol

1. إعداد اللقاح البكتيري

  1. قم بإزالة قارورة مخزون الجلسرين المخزنة في -80 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة السلالة البكتيرية (2-10 ميكرولتر) من القارورة باستخدام طرف ماصة معقم.
    ملاحظة: تستخدم سلالات الراكدة ، A. bouvetii (13-1-1) ، A. junii (13-1-2) ، A. pittii (13-2-5) ، A. baumannii (13-2-9) ، A. radioresistens (20-1) ، و A. ursingii (24-1) في هذا البروتوكول.
  3. تلقيح صفيحة أجار الدم المتاحة تجاريا (أجار الصويا التربتي المكمل ب 5٪ دم غنم ، انظر جدول المواد) بالبكتيريا.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسائط أخرى ، مثل أجار المغذيات أو أجار MacConkey.
  4. <....

النتائج

وفقا للبروتوكول ، تم تشكيل الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter ، المعزولة أصلا من أسطح المطبخ ، على صفيحة من البوليسترين 96 بئرا ، ملطخة بالبنفسج البلوري ، وتم إذابة الأصباغ في الإيثانول وقياسها لكتلة الأغشية الحيوية (الشكل 1). ويختلف عدد الأغشية الحيوية تفاوتا كبيرا تبعا ل?.......

Discussion

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم قياس تكوين الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter بدرجات متفاوتة ، وتصورها ، وتم تقدير الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3).

في هذا البروتوكول ، تم استخدام درجتي ح?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث الرئيسي (E0210702-03) التابع للمعهد الكوري لبحوث الأغذية (KFRI) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well cell culture plateSPL30096Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) brothMerck KGaA1.10493.0500
Blood Agar Base PlateKisanBioMB-B1005-P50Growth media for Acinetobacter
CHROMagar AcinetobacterCHROMagarAC092Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solutionSigma-AldrichV5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kitInvitrogenL10316SYTO9 and propidium iodide
Microplate readerTecanInfinite M200 PRO NanoQuantBiofilm measurement
RBC Glass Plating BeadsRBCRG001Glass beads
μ-Plate 96 Well Blackibidi89621Microplate intended for CLSM

References

  1. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
  2. Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SYTO9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved