Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تحضير اللقاح ، والقياس الكمي للغشاء الحيوي على ألواح العيار الدقيق باستخدام صبغة البنفسج البلوري ، والعدد القابل للتطبيق في الأغشية الحيوية ، وتصور الأغشية الحيوية للراكدة.

Abstract

تسبب الراكدة عدوى المستشفيات ويمكن أن يساهم تكوين الأغشية الحيوية في البقاء على الأسطح الجافة مثل بيئات المستشفيات. وبالتالي ، فإن القياس الكمي والأغشية الحيوية والتصور هما طريقتان مهمتان لتقييم إمكانات سلالات الراكدة للتسبب في عدوى المستشفيات. يمكن قياس الأغشية الحيوية المتكونة على سطح الصفيحة الدقيقة من حيث الحجم وأعداد الخلايا. يمكن قياس أحجام الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخها باستخدام البنفسج البلوري ، والغسيل ، وإزالة البقع باستخدام الإيثانول ، ثم قياس الصبغة القابلة للذوبان باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. لتحديد عدد الخلايا المضمنة في الأغشية الحيوية ، يتم التخلص من الأغشية الحيوية باستخدام كاشطات الخلايا ، ويتم حصادها في المياه المالحة ، وتحريكها بقوة في وجود حبات زجاجية ، وتنتشر على أجار Acinetobacter. بعد ذلك ، يتم تحضين الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة. بعد الحضانة ، يتم تعداد المستعمرات الحمراء لتقدير عدد الخلايا في الأغشية الحيوية. يمكن أن تكون طريقة العد القابلة للتطبيق هذه مفيدة أيضا لحساب خلايا Acinetobacter في الأغشية الحيوية المختلطة الأنواع. يمكن تصور الأغشية الحيوية الراكدة باستخدام أصباغ الفلورسنت. يتم استخدام صفيحة مجهرية متاحة تجاريا مصممة للتحليل المجهري لتشكيل الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي بأصباغ SYTO9 و propidium iodide ، وغسلها ، ثم تصورها باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

Introduction

من المعروف أن الراكدة تسبب عدوى المستشفيات ، ويتم الإبلاغ عن عدواها البشرية ، خاصة في مرافق الرعاية الصحية ، بشكل متزايد1. ينتشر على نطاق واسع في المستشفيات ومرافق الرعاية الصحية والبيئات المرتبطة بالغذاء2،3،4. يمكن أن يعيش لفترة طويلة في البيئات بما في ذلك أسطح المستشفيات مثل قضبان السرير وطاولات السرير وسطح أجهزة التهوية والأحواض4. قد يكون هذا الثبات على الأسطح البيئية أحد العوامل المهمة التي تساهم في عدوى المستشفيات من Acinetobacter4.

الأغشية الحيوية هي شكل من أشكال الحياة الميكروبية وهي عبارة عن مصفوفة ميكروبية تتكون من خلايا ميكروبية حية ومواد بوليمرية خارج الخلية (EPS) من الخلايا5. يتم تضمين الخلايا الميكروبية في المصفوفة وغالبا ما تكون شديدة المقاومة للضغوط البيئية مثل الحرارة والأملاح والجفاف والمضادات الحيوية والمطهرات وقوى القص 6,7.

يمكن أن تشكل الراكدة الأغشية الحيوية على الأسطح ، مما يشير إلى أنها قد تساهم في إطالة البقاء على الأسطح البيئية ، بما في ذلك أسطح المستشفيات ، وتعزيز المقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يرتبط تكوين الأغشية الحيوية للراكدة بشكل كبير بالنتائج السريرية البشرية8. لذلك ، يمكن أن تكون قابلية تكوين الأغشية الحيوية لسلالات Acinetobacter أحد المؤشرات في التنبؤ بالبقاء البيئي والعدوى البشرية 8,10.

يمكن قياس الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح وتصورها لتقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية. ولتحديد كمية الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح، عادة ما تكون الأغشية الحيوية ملطخة بأصباغ ملطخة بالأغشية الحيوية مثل البنفسج البلوري، ويتم استخلاص الأصباغ في محلول وقياسها للكثافة البصرية11. يعد تصور الأغشية الحيوية نهجا جيدا آخر لتقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية11. يمكن أن تكون طريقة التصور المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) التي تستخدم الخصوصية باستخدام أصباغ الفلورسنت أكثر فائدة لتوصيف مورفولوجيا الأغشية الحيوية مقارنة بالتقنيات الأخرى مثل SEM12،13.

يمكن عد الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية لتقدير عدد الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية11. يتم فصل الخلايا القابلة للحياة المضمنة في الأغشية الحيوية وتخفيفها ونشرها على ألواح الآجار وتحضينها وتعدادها. نظرا لأن العدد الأكبر من الخلايا من المحتمل أن يلبي الجرعة المعدية ، فإنه يمكن أن يوفر معلومات أكثر تفصيلا عن الأغشية الحيوية ، مثل إمكانات العدوى المرتبطة بعدد الخلايا13,14.

تقدم هذه المقالة بروتوكولات خطوة بخطوة من أجل (1) تحديد الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح ، (2) حساب الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية ، و (3) تصور الأغشية الحيوية باستخدام CLSM من Acinetobacter. تصف البروتوكولات المقدمة طرق تقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية لعزلات الراكدة وأغشية الراكدة وتوصيف الأغشية الحيوية الخاصة بها.

Protocol

1. إعداد اللقاح البكتيري

  1. قم بإزالة قارورة مخزون الجلسرين المخزنة في -80 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة السلالة البكتيرية (2-10 ميكرولتر) من القارورة باستخدام طرف ماصة معقم.
    ملاحظة: تستخدم سلالات الراكدة ، A. bouvetii (13-1-1) ، A. junii (13-1-2) ، A. pittii (13-2-5) ، A. baumannii (13-2-9) ، A. radioresistens (20-1) ، و A. ursingii (24-1) في هذا البروتوكول.
  3. تلقيح صفيحة أجار الدم المتاحة تجاريا (أجار الصويا التربتي المكمل ب 5٪ دم غنم ، انظر جدول المواد) بالبكتيريا.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسائط أخرى ، مثل أجار المغذيات أو أجار MacConkey.
  4. قم بخط سطح أجار باستخدام حلقة معقمة مع اشتعال متقطع لتخفيفه.
  5. ضع صفيحة الآجار رأسا على عقب في حاضنة واحتضانها عند 30 درجة مئوية طوال الليل لمدة 20-24 ساعة.
  6. اختر مستعمرة واحدة من الثقافة البكتيرية بإبرة معقمة وقم بتلقيح مرق تسريب قلب الدماغ المعقم 5 مل (BHI ، انظر جدول المواد) مع الثقافة.
  7. احتضان المرق الملقح في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية طوال الليل لمدة 20-24 ساعة عند حوالي 150 دورة في الدقيقة.
  8. نقل 1 مل من الثقافة الليلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وأجهزة طرد مركزي للثقافة الليلية عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. إزالة طاف مع ماصة.
  10. باستخدام دوامة ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
  11. أجهزة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 10 دقائق في RT وإزالة طاف.
  12. أعد تعليق الحبيبات في BHI المخفف المعقم بعشرة أضعاف باستخدام دوامة إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي 0.1 عند 600 نانومتر.
    ملاحظة: الكثافة البصرية حوالي 0.1 تعادل حوالي 107 CFU / mL.

2. قياس كمية الأغشية الحيوية باستخدام البنفسج الكريستالي

  1. أضف 200 ميكرولتر لقاح إلى كل بئر من صفيحة معقمة من البوليسترين 96 بئرا (انظر جدول المواد) وأضف 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر من الآبار الخارجية لمنع الآبار الداخلية من الجفاف15.
  2. أضف 200 ميكرولتر من BHI المخفف بعشرة أضعاف إلى كل بئر من نفس اللوحة كعنصر تحكم سلبي.
  3. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. إزالة طاف مع ماصة.
    ملاحظة: غالبا ما تكون الماصة متعددة القنوات أكثر ملاءمة لعينات متعددة.
  5. أضف بعناية 300 ميكرولتر PBS إلى كل بئر وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
    ملاحظة: غالبا ما تكون الماصة متعددة القنوات أكثر ملاءمة لعينات متعددة.
  6. كرر الخطوة 2.5 مرتين أخريين.
  7. أضف 200 ميكرولتر من محلول البنفسج البلوري (1٪) (انظر جدول المواد) إلى كل بئر واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  8. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.6.
  9. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى كل بئر واحتضانها لمدة 15 دقيقة في RT. اخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  10. انقل شطف 100 ميكرولتر من كل بئر إلى لوحة جديدة سعة 96 بئرا.
  11. قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (انظر جدول المواد).
  12. عندما يتجاوز الامتصاص 2.0 ، قم بإجراء تخفيف مناسب للعينة إلى الامتصاص أقل من 2.0 في الإيثانول المطلق وقم بقياسه كما في الخطوة 2.11. ثم احسب امتصاص العينة (القيمة النهائية) بضرب القيمة المرصودة في عامل التخفيف.
  13. احسب الامتصاص الحقيقي للعينات عن طريق طرح متوسط قيمة التحكم السلبي من قيمة كل بئر من عينات الاختبار على نفس لوحة البئر.

3. عدد صلاحية الأغشية الحيوية

  1. أضف 1 مل لقاح (الخطوة 1) إلى كل بئر من لوحة البوليسترين المعقمة ذات 12 بئرا15. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إزالة طاف مع ماصة.
  2. أضف بعناية 1.5 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى كل بئر وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى كل بئر.
  3. اكشط الأسطح السفلية والجدارية للبئر باستخدام كاشطات الخلايا المجهزة.
  4. انقل معلق الخلية المحصودة إلى أنبوب بلاستيكي معقم (10-1) يحتوي على 9 مل من محلول ملحي (0.85٪ كلوريد الصوديوم) و 10-20 حبة زجاجية (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لجمع أي حطام بيوفيلم متبقي على السطح السفلي للبئر ، يمكن إعادة تعليقه ونقله بواسطة ماصة باستخدام محلول ملحي من أنبوب 10-1 .
  5. دوامة أنبوب 10-1 لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة.
  6. قم بعمل تخفيف تسلسلي بمقدار 10 أضعاف عن طريق نقل 1 مل إلى الأنبوب المعقم التالي (10-2) الذي يحتوي على 9 مل محلول ملحي (0.85٪ كلوريد الصوديوم) حتى 10-7.
  7. انشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على أجار Acinetobacter (انظر جدول المواد) واحتضان ألواح الآجار عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة.
  8. احسب عدد المستعمرات الحمراء النموذجية على كل لوحة يدويا في النطاق بين 10 و 250.
  9. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة في الغشاء الحيوي لكل بئر باستخدام المعادلة أدناه:
    خلايا قابلة للحياة = عدد المستعمرات × عوامل التخفيف × 10

4. تصور الأغشية الحيوية باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM)

  1. أضف 200 ميكرولتر لقاح إلى كل بئر من صفيحة معقمة ذات 96 بئرا مخصصة للتحليل المجهري.
  2. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. إزالة طاف مع ماصة.
  4. أضف بعناية 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات بالفلتر إلى كل بئر وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
  5. كرر الخطوة 4.4.
  6. تحضير خليط SYTO 9 ويوديد البروبيديوم (انظر جدول المواد) المخفف في الماء منزوع الأيونات المعقم بالفلتر إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر و 60 ميكرومتر ، على التوالي.
  7. أضف الخليط إلى كل بئر عند 200 ميكرولتر واحتضن الطبق لمدة 20-30 دقيقة في RT في الظلام.
  8. كرر الخطوات 4.3-4.4
  9. تصور الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي باستخدام CLSM بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر و 561 نانومتر ونطاق الطول الموجي للانبعاث 499-535 نانومتر و 568-712 نانومتر على التوالي.

النتائج

وفقا للبروتوكول ، تم تشكيل الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter ، المعزولة أصلا من أسطح المطبخ ، على صفيحة من البوليسترين 96 بئرا ، ملطخة بالبنفسج البلوري ، وتم إذابة الأصباغ في الإيثانول وقياسها لكتلة الأغشية الحيوية (الشكل 1). ويختلف عدد الأغشية الحيوية تفاوتا كبيرا تبعا ل?...

Discussion

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم قياس تكوين الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter بدرجات متفاوتة ، وتصورها ، وتم تقدير الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3).

في هذا البروتوكول ، تم استخدام درجتي ح?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث الرئيسي (E0210702-03) التابع للمعهد الكوري لبحوث الأغذية (KFRI) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well cell culture plateSPL30096Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) brothMerck KGaA1.10493.0500
Blood Agar Base PlateKisanBioMB-B1005-P50Growth media for Acinetobacter
CHROMagar AcinetobacterCHROMagarAC092Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solutionSigma-AldrichV5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kitInvitrogenL10316SYTO9 and propidium iodide
Microplate readerTecanInfinite M200 PRO NanoQuantBiofilm measurement
RBC Glass Plating BeadsRBCRG001Glass beads
μ-Plate 96 Well Blackibidi89621Microplate intended for CLSM

References

  1. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
  2. Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
  3. Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
  4. Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
  5. Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
  6. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  7. Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
  8. Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
  9. Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
  10. Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
  11. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  12. Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
  13. Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
  14. Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
  15. Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
  16. Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
  17. Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
  18. Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
  19. Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
  20. Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
  21. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
  22. McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SYTO9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved