Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает подготовку посевного материала, количественное определение биопленки на микротитровых планшетах с использованием кристаллического фиолетового красителя, количество жизнеспособных веществ в биопленках и визуализацию биопленок Acinetobacter.

Аннотация

Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и его образование биопленки может способствовать выживанию на сухих поверхностях, таких как больничные условия. Таким образом, количественная оценка и визуализация биопленки являются важными методами оценки способности штаммов Acinetobacter вызывать внутрибольничные инфекции. Биопленки, образующиеся на поверхности микропланшета, могут быть количественно оценены с точки зрения объема и количества клеток. Объемы биопленки могут быть количественно определены путем окрашивания с помощью кристаллического фиолетового, промывки, обесцвечивания с использованием этанола, а затем измерения солюбилизированного красителя с помощью микропланшетного ридера. Чтобы количественно определить количество клеток, встроенных в биопленки, биопленки соскребают с помощью клеточных скребков, собирают в физиологическом растворе, энергично перемешивают в присутствии стеклянных шариков и наносят на агар Acinetobacter. Затем планшеты инкубируют при 30 °C в течение 24-42 ч. После инкубации красные колонии нумеруются, чтобы оценить количество клеток в биопленках. Этот жизнеспособный метод подсчета также может быть полезен для подсчета клеток Acinetobacter в биопленках смешанных видов. Биопленки Acinetobacter можно визуализировать с помощью флуоресцентных красителей. Коммерчески доступная микропланшет, предназначенная для микроскопического анализа, используется для формирования биопленок. Затем биопленки, прикрепленные к нижней поверхности, окрашивают красителями SYTO9 и пропидидом пропидия, промывают и визуализируют с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Введение

Известно, что Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и всечаще регистрируется заражение людей, особенно в медицинских учреждениях1. Он широко распространен в больницах, медицинских учреждениях и пищевых продуктах 2,3,4. Он может выживать в течение длительного периода времени в различных средах, включая больничные поверхности, такие как поручни кроватей, прикроватные тумбочки, поверхность аппаратов искусственной вентиляции легких и раковины4. Такая персистенция на поверхностях окружающей среды может быть одним....

протокол

1. Подготовка бактериального посевного материала

  1. Снимите флакон с глицерином, хранящийся при температуре -80 °C.
  2. Удалить бактериальный штамм (2-10 мкл) из флакона с помощью стерильного наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются штаммы Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) и A. ursingii (24-1).
  3. Засейте бактериями коммерчески доступную пластину кровяного агара (триптический соевый агар с добавлением 5% овечьей крови, см. таблицу материалов

Результаты

В соответствии с протоколом, биопленки изолятов Acinetobacter , первоначально выделенных с кухонных поверхностей, формировали на полистирольной 96-луночной пластине, окрашивали кристаллическим фиолетовым, а красители растворяли в этаноле и измеряли по массе биопленки (рис. 1

Обсуждение

С помощью описанного протокола измеряли, визуализировали биопленкообразование изолятов Acinetobacter в разной степени и оценивали жизнеспособные клетки в биопленках (рис. 1, рис. 2 и рис. 3).

В этом протоколе использовались дв.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Основной исследовательской программой (E0210702-03) Корейского научно-исследовательского института пищевых продуктов (KFRI), финансируемой Министерством науки и ИКТ.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well cell culture plateSPL30096Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) brothMerck KGaA1.10493.0500
Blood Agar Base PlateKisanBioMB-B1005-P50Growth media for Acinetobacter
CHROMagar AcinetobacterCHROMagarAC092Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solutionSigma-AldrichV5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kitInvitrogenL10316SYTO9 and propidium iodide
Microplate readerTecanInfinite M200 PRO NanoQuantBiofilm measurement
RBC Glass Plating BeadsRBCRG001Glass beads
μ-Plate 96 Well Blackibidi89621Microplate intended for CLSM

Ссылки

  1. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
  2. Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

AcinetobacterAcinetobacterSYTO9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены