Стратегии количественной оценки, оценки жизнеспособности и визуализации биопленок Acinetobacter

Резюме

Этот протокол описывает подготовку посевного материала, количественное определение биопленки на микротитровых планшетах с использованием кристаллического фиолетового красителя, количество жизнеспособных веществ в биопленках и визуализацию биопленок Acinetobacter.

Аннотация

Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и его образование биопленки может способствовать выживанию на сухих поверхностях, таких как больничные условия. Таким образом, количественная оценка и визуализация биопленки являются важными методами оценки способности штаммов Acinetobacter вызывать внутрибольничные инфекции. Биопленки, образующиеся на поверхности микропланшета, могут быть количественно оценены с точки зрения объема и количества клеток. Объемы биопленки могут быть количественно определены путем окрашивания с помощью кристаллического фиолетового, промывки, обесцвечивания с использованием этанола, а затем измерения солюбилизированного красителя с помощью микропланшетного ридера. Чтобы количественно определить количество клеток, встроенных в биопленки, биопленки соскребают с помощью клеточных скребков, собирают в физиологическом растворе, энергично перемешивают в присутствии стеклянных шариков и наносят на агар Acinetobacter. Затем планшеты инкубируют при 30 °C в течение 24-42 ч. После инкубации красные колонии нумеруются, чтобы оценить количество клеток в биопленках. Этот жизнеспособный метод подсчета также может быть полезен для подсчета клеток Acinetobacter в биопленках смешанных видов. Биопленки Acinetobacter можно визуализировать с помощью флуоресцентных красителей. Коммерчески доступная микропланшет, предназначенная для микроскопического анализа, используется для формирования биопленок. Затем биопленки, прикрепленные к нижней поверхности, окрашивают красителями SYTO9 и пропидидом пропидия, промывают и визуализируют с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Введение

Известно, что Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и все^{чаще регистрируется} заражение людей, особенно в медицинских учреждениях1. Он широко распространен в больницах, медицинских учреждениях и пищевых продуктах ^2,3,4. Он может выживать в течение длительного периода времени в различных средах, включая больничные поверхности, такие как поручни кроватей, прикроватные тумбочки, поверхность аппаратов искусственной вентиляции легких и раковины⁴. Такая персистенция на поверхностях окружающей среды может быть одним....

протокол

1. Подготовка бактериального посевного материала

1. Снимите флакон с глицерином, хранящийся при температуре -80 °C.
2. Удалить бактериальный штамм (2-10 мкл) из флакона с помощью стерильного наконечника пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются штаммы Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) и A. ursingii (24-1).
3. Засейте бактериями коммерчески доступную пластину кровяного агара (триптический соевый агар с добавлением 5% овечьей крови, см. таблицу материалов

Результаты

В соответствии с протоколом, биопленки изолятов Acinetobacter , первоначально выделенных с кухонных поверхностей, формировали на полистирольной 96-луночной пластине, окрашивали кристаллическим фиолетовым, а красители растворяли в этаноле и измеряли по массе биопленки (рис. 1

Обсуждение

С помощью описанного протокола измеряли, визуализировали биопленкообразование изолятов Acinetobacter в разной степени и оценивали жизнеспособные клетки в биопленках (рис. 1, рис. 2 и рис. 3).

В этом протоколе использовались дв.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM