Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Özet

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Özet

Acinetobacter hastane enfeksiyonlarına neden olur ve biyofilm oluşumu hastane ortamları gibi kuru yüzeylerde sağkalıma katkıda bulunabilir. Bu nedenle, biyofilm ölçümü ve görselleştirme, Acinetobacter suşlarının hastane enfeksiyonlarına neden olma potansiyelini değerlendirmek için önemli yöntemlerdir. Mikroplakanın yüzeyinde oluşan biyofilmler, hacim ve hücre sayıları açısından ölçülebilir. Biyofilm hacimleri, kristal viyole kullanılarak boyanarak, yıkanarak, etanol kullanılarak leke çıkarılarak ve ardından bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözündürülmüş boyanın ölçülmesiyle ölçülebilir. Biyofilmlere gömülü hücrelerin sayısını ölçmek için, biyofilmler hücre sıyırıcılar kullanılarak sıyrılır, tuzlu suda hasat edilir, cam boncukların varlığında kuvvetlice çalkalanır ve Acinetobacter agar üzerine yayılır. Daha sonra plakalar 30 °C'de 24-42 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, biyofilmlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için kırmızı koloniler numaralandırılır. Bu uygulanabilir sayım yöntemi, karışık tür biyofilmlerdeki Acinetobacter hücrelerini saymak için de yararlı olabilir. Acinetobacter biyofilmleri, floresan boyalar kullanılarak görselleştirilebilir. Biyofilm oluşturmak için mikroskobik analiz için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikroplaka kullanılır. Daha sonra, alt yüzeye yapıştırılan biyofilmler SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları ile boyanır, yıkanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görselleştirilir.

Giriş

Acinetobacter'in hastane enfeksiyonlarına neden olduğu bilinmektedir ve özellikle sağlık tesislerinde insan enfeksiyonu giderek daha fazla bildirilmektedir¹. Hastanelerde, sağlık tesislerinde ve gıda ile ilişkili ortamlarda yaygındır ^2,3,4. Yatak korkulukları, komodinler, vantilatörlerin yüzeyleri ve lavabolar gibi hastane yüzeyleri dahil ortamlarda uzun süre hayatta kalabilir⁴. Çevresel yüzeylerde bu tür bir kalıcılık, Acinetobacter^4'ün hastane enfeksiyonlarına katkıda bulunan önemli fa....

Protokol

1. Bakteri aşısının hazırlanması

1. -80 °C'de saklanan gliserol stok şişesini çıkarın.
2. Steril bir pipet ucu kullanarak bakteri suşunu (2-10 μL) flakondan çıkarın.
   NOT: Bu protokolde Acinetobacter suşları, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ve A. ursingii (24-1) kullanılmaktadır.
3. Piyasada bulunan bir kanlı agar plakasını (% 5 koyun kanı ile desteklenmiş triptik soya agarı, Malzeme Tablosuna bakınız) bakterilerle aşılayın.
   NOT: Besleyici agar veya MacConkey agar gibi di....

Tartışmalar

Açıklanan protokol kullanılarak, değişen derecelerde Acinetobacter izolatlarının biyofilm oluşumu ölçüldü, görselleştirildi ve biyofilmlerdeki canlı hücreler tahmin edildi (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3).

Bu protokolde Acinetobacter'in büyümesi için 30 °C ve biyofilm oluşumu için 25 °C olmak üzere iki farklı sıcaklık kullanılmıştır. 30 °C kullanıldı, ç.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM