Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Özet

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Özet

Acinetobacter hastane enfeksiyonlarına neden olur ve biyofilm oluşumu hastane ortamları gibi kuru yüzeylerde sağkalıma katkıda bulunabilir. Bu nedenle, biyofilm ölçümü ve görselleştirme, Acinetobacter suşlarının hastane enfeksiyonlarına neden olma potansiyelini değerlendirmek için önemli yöntemlerdir. Mikroplakanın yüzeyinde oluşan biyofilmler, hacim ve hücre sayıları açısından ölçülebilir. Biyofilm hacimleri, kristal viyole kullanılarak boyanarak, yıkanarak, etanol kullanılarak leke çıkarılarak ve ardından bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözündürülmüş boyanın ölçülmesiyle ölçülebilir. Biyofilmlere gömülü hücrelerin sayısını ölçmek için, biyofilmler hücre sıyırıcılar kullanılarak sıyrılır, tuzlu suda hasat edilir, cam boncukların varlığında kuvvetlice çalkalanır ve Acinetobacter agar üzerine yayılır. Daha sonra plakalar 30 °C'de 24-42 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, biyofilmlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için kırmızı koloniler numaralandırılır. Bu uygulanabilir sayım yöntemi, karışık tür biyofilmlerdeki Acinetobacter hücrelerini saymak için de yararlı olabilir. Acinetobacter biyofilmleri, floresan boyalar kullanılarak görselleştirilebilir. Biyofilm oluşturmak için mikroskobik analiz için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikroplaka kullanılır. Daha sonra, alt yüzeye yapıştırılan biyofilmler SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları ile boyanır, yıkanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görselleştirilir.

Giriş

Acinetobacter'in hastane enfeksiyonlarına neden olduğu bilinmektedir ve özellikle sağlık tesislerinde insan enfeksiyonu giderek daha fazla bildirilmektedir¹. Hastanelerde, sağlık tesislerinde ve gıda ile ilişkili ortamlarda yaygındır ^2,3,4. Yatak korkulukları, komodinler, vantilatörlerin yüzeyleri ve lavabolar gibi hastane yüzeyleri dahil ortamlarda uzun süre hayatta kalabilir⁴. Çevresel yüzeylerde bu tür bir kalıcılık, Acinetobacter^4'ün hastane enfeksiyonlarına katkıda bulunan önemli faktörlerden biri olabilir.

Biyofilm, mikrobiyal yaşamın bir şeklidir ve canlı mikrobiyal hücrelerden ve hücrelerden hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan mikrobiyal bir matristir⁵. Mikrobiyal hücreler matrise gömülüdür ve genellikle ısı, tuzlar, kuruluk, antibiyotikler, dezenfektanlar ve kesme kuvvetleri^gibi çevresel streslere karşı oldukça dirençlidir ^6,7.

Acinetobacter yüzeylerde biyofilmler oluşturabilir, bu da hastane yüzeyleri de dahil olmak üzere çevresel yüzeylerde uzun süreli sağkalıma ve antibiyotik tedavisine^karşı direncin artmasına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir ^8,9. Ek olarak, Acinetobacter'in biyofilm oluşumu, insan klinik sonuçlarıyla yüksek oranda ilişkili olabilir⁸. Bu nedenle, Acinetobacter suşlarının biyofilm şekillendirilebilirliği, çevresel sağkalımı ve insan enfeksiyonlarını tahmin etmede göstergelerden biri olabilir ^8,10.

Yüzeye bağlı biyofilmler, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için ölçülebilir ve görselleştirilebilir. Yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek için, biyofilmler normalde kristal viyole gibi biyofilm boyama boyaları ile boyanır ve boyalar çözelti içinde ayrıştırılır ve optik yoğunluk¹¹ için ölçülür. Biyofilmlerin görselleştirilmesi, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için başka bir iyi yaklaşımdır¹¹. Floresan boyalar kullanılarak özgüllüğü kullanan konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) görselleştirme yöntemi, SEM^12,13 gibi diğer tekniklere kıyasla biyofilm morfolojisini karakterize etmek için daha yararlı olabilir.

Biyofilmlerdeki canlı hücreler, biyofilmlerdeki canlı hücrelerin sayısını tahmin etmek için sayılabilir¹¹. Biyofilmlere gömülü canlı hücreler ayrılır, seyreltilir, agar plakalarına yayılır, inkübe edilir ve numaralandırılır. Daha fazla sayıda hücrenin enfeksiyöz dozu karşılaması muhtemel olduğundan, hücre sayısı^13,14 ile ilişkili enfeksiyon potansiyelleri gibi biyofilmler hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlayabilir.

Bu makale, (1) yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek, (2) biyofilmlerdeki canlı hücreleri saymak ve (3) Acinetobacter'in CLSM'sini kullanarak biyofilmleri görselleştirmek için adım adım protokoller sunmaktadır. Sunulan protokoller, Acinetobacter izolatlarının biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirme ve biyofilmlerini karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır.

Protokol

1. Bakteri aşısının hazırlanması

1. -80 °C'de saklanan gliserol stok şişesini çıkarın.
2. Steril bir pipet ucu kullanarak bakteri suşunu (2-10 μL) flakondan çıkarın.
   NOT: Bu protokolde Acinetobacter suşları, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ve A. ursingii (24-1) kullanılmaktadır.
3. Piyasada bulunan bir kanlı agar plakasını (% 5 koyun kanı ile desteklenmiş triptik soya agarı, Malzeme Tablosuna bakınız) bakterilerle aşılayın.
   NOT: Besleyici agar veya MacConkey agar gibi diğer ortamlar da kullanılabilir.
4. Agar yüzeyini inceltmek için aralıklı alevli steril bir halka kullanarak çizin.
5. Agar plakasını bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de 20-24 saat inkübe edin.
6. Steril bir iğne ile bakteri kültürünün tek bir kolonisini seçin ve kültürle birlikte 5 mL steril beyin kalp infüzyon suyunu (BHI, Malzeme Tablosuna bakınız) aşılayın.
7. Aşılanmış suyu 30 °C'de çalkalayan bir inkübatörde gece boyunca 20-24 saat yaklaşık 150 rpm'de inkübe edin.
8. Gece kültürünün 1 mL'sini steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve gece kültürünü oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin.
9. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
10. Bir girdap kullanarak, peleti 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.
11. RT'de 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
12. Pelet, 600 nm'de yaklaşık 0.1'lik bir optik yoğunluğa kadar vorteks kullanarak steril on kat seyreltilmiş BHI'de yeniden süspanse edin.
    NOT: Yaklaşık 0.1'lik optik yoğunluk yaklaşık 10⁷ CFU/mL'ye eşdeğerdir.

2. Kristal viyole kullanarak biyofilm ölçümü

1. Steril polistiren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL inokulum ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve iç kuyucukların kurumasını önlemek için en dıştaki kuyucukların her birine 200 μL deiyonize su ekleyin¹⁵.
2. Negatif kontrol olarak aynı plakanın her bir oyuğuna 200 μL on kat seyreltilmiş BHI ekleyin.
3. Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin.
4. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
   NOT: Çok kanallı pipet genellikle birden fazla numune için daha uygundur.
5. Her bir oyuğa dikkatlice 300 μL PBS ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.
   NOT: Çok kanallı pipet genellikle birden fazla numune için daha uygundur.
6. Adım 2.5'i iki kez daha tekrarlayın.
7. Her bir oyuğa 200 μL kristal viyole çözeltisi (% 1) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
8. 2.4-2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
9. Her oyuğa 200 μL mutlak etanol ekleyin ve RT'de 15 dakika inkübe edin.
10. Her kuyucuktan 100 μL elüsyon yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.
11. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 595 nm'de ölçün (bkz.
12. Absorbans 2.0'ı aştığında, numunenin mutlak etanolde absorbansın 2.0'ın altına kadar uygun bir şekilde seyreltilmesini sağlayın ve adım 2.11'deki gibi ölçün. Ardından, gözlemlenen değeri seyreltme faktörü ile çarparak numunenin absorbansını (nihai değer) hesaplayın.
13. Negatif kontrolün ortalama değerini, aynı kuyu plakasındaki test numunelerinin her bir oyuğunun değerinden çıkararak numunelerin gerçek absorbansını hesaplayın.

3. Biyofilm canlılık sayımı

1. Steril polistiren 12 oyuklu plakanın¹⁵ her bir oyuğuna 1 mL inokulum (adım 1) ekleyin. Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
2. Her bir oyuğa dikkatlice 1.5 mL steril PBS ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. Her kuyucuğa 1 mL steril PBS ekleyin.
3. Takılı hücre sıyırıcıları kullanarak kuyunun alt ve duvar yüzeylerini kazıyın.
4. Hasat edilen hücre süspansiyonunu 9 mL salin (%0.85 NaCl) ve 10-20 cam boncuk içeren steril bir plastik tüpe (^10-1) aktarın (bkz.
   NOT: Kuyunun alt yüzeyinde kalan artık biyofilm kalıntılarını toplamak için, ^10-1 tüpünden salin kullanılarak pipetle yeniden süspanse edilebilir ve aktarılabilir.
5. ^10-1 tüpü maksimum hızda 60 saniye boyunca vorteksleyin.
6. ^10-7'ye kadar 9 mL salin (% 0.85 NaCl) içeren bir sonraki steril tüpe (^10-2) 1 mL aktararak 10 kat seri seyreltme yapın.
7. Acinetobacter agar üzerine her seyreltmeden 100 μL yayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve agar plakalarını 30 °C'de 24-42 saat inkübe edin.
8. Her plakadaki tipik kırmızı kolonilerin sayısını 10 ile 250 arasında manuel olarak sayın.
9. Aşağıdaki denklemi kullanarak her bir kuyucuğun biyofilmindeki canlı hücre sayısını hesaplayın:
   Canlı hücreler = Koloni sayısı × Seyreltme faktörleri × 10

4. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak biyofilm görselleştirme

1. Mikroskobik analiz için amaçlanan steril 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL inokülum ekleyin.
2. Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin.
3. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
4. Her bir kuyucuğa dikkatlice 300 μL filtre ile sterilize edilmiş deiyonize su ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.
5. Adım 4.4'ü tekrarlayın.
6. Filtreyle sterilize edilmiş deiyonize suda sırasıyla 10 μM ve 60 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş SYTO 9 ve propidyum iyodür karışımını ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın.
7. Karışımı her bir oyuğa 200 μL'de ekleyin ve plakayı karanlıkta RT'de 20-30 dakika inkübe edin.
8. 4.3-4.4 arasındaki adımları tekrarlayın
9. Sırasıyla 488 nm ve 561 nm uyarma dalga boyuna ve 499-535 nm ve 568-712 nm emisyon dalga boyu aralığına sahip CLSM kullanarak alt yüzeye bağlı biyofilmleri görselleştirin.

Sonuçlar

Protokolü takiben, orijinal olarak mutfak yüzeylerinden izole edilen Acinetobacter izolatlarının biyofilmleri, kristal viyole ile boyanmış polistiren 96 oyuklu bir plaka üzerinde oluşturuldu ve boyalar etanol içinde çözündürüldü ve biyofilm kütlesi için ölçüldü (Şekil 1). Biyofilm sayısı, OD 0.04 ila 1.69 arasında değişen suşlara bağlı olarak büyük ölçüde değişmiştir (Şekil 1). Stepanović ve ^ark....

Tartışmalar

Açıklanan protokol kullanılarak, değişen derecelerde Acinetobacter izolatlarının biyofilm oluşumu ölçüldü, görselleştirildi ve biyofilmlerdeki canlı hücreler tahmin edildi (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3).

Bu protokolde Acinetobacter'in büyümesi için 30 °C ve biyofilm oluşumu için 25 °C olmak üzere iki farklı sıcaklık kullanılmıştır. 30 °C kullanıldı, ç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM