Estrategias de cuantificación, evaluación de viabilidad y visualización de biopelículas de Acinetobacter

Resumen

Este protocolo describe la preparación del inóculo, la cuantificación de la biopelícula en placas de microtitulación utilizando colorante violeta cristalino, el recuento viable en biopelículas y la visualización de biopelículas de Acinetobacter.

Resumen

Acinetobacter causa infecciones nosocomiales y su formación de biopelículas puede contribuir a la supervivencia en superficies secas como entornos hospitalarios. Por lo tanto, la cuantificación y visualización de biopelículas son métodos importantes para evaluar el potencial de las cepas de Acinetobacter para causar infecciones nosocomiales. Las biopelículas que se forman en la superficie de la microplaca se pueden cuantificar en términos de volumen y número de células. Los volúmenes de biopelícula se pueden cuantificar mediante tinción con violeta cristalino, lavado, decoloración con etanol y luego midiendo el colorante solubilizado con un lector de microplacas. Para cuantificar el número de células incrustadas en las biopelículas, las biopelículas se desechan utilizando raspadores celulares, se cosechan en la solución salina, se agitan vigorosamente en presencia de perlas de vidrio y se esparcen en agar Acinetobacter. A continuación, las placas se incuban a 30 °C durante 24-42 h. Después de la incubación, las colonias rojas se enumeran para estimar el número de células en las biopelículas. Este método de recuento viable también puede ser útil para contar células de Acinetobacter en biopelículas de especies mixtas. Las biopelículas de Acinetobacter se pueden visualizar utilizando tintes fluorescentes. Se emplea una microplaca disponible en el mercado diseñada para el análisis microscópico para formar biopelículas. A continuación, las biopelículas adheridas a la superficie inferior se tiñen con colorantes de yoduro de propidio y SYTO9, se lavan y luego se visualizan con microscopía de barrido láser confocal.

Introducción

Se sabe que Acinetobacter causa infecciones nosocomiales, y su infección en humanos, especialmente en centros de salud, se reporta cada vez más¹. Está muy extendido en hospitales, centros de salud y entornos asociados a los alimentos ^2,3,4. Puede sobrevivir durante un largo período en entornos que incluyen superficies hospitalarias como barandillas de camas, mesitas de noche, la superficie de ventiladores y lavabos⁴. Tal persistencia en las superficies ambientales puede ser uno de los factores significativos que contrib....

Protocolo

1. Preparación del inóculo bacteriano

1. Retire el vial de caldo de glicerol almacenado a -80 °C.
2. Retire la cepa bacteriana (2-10 μL) del vial con una punta de pipeta estéril.
   NOTA: En este protocolo se utilizan cepas de Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) y A. ursingii (24-1).
3. Inocular una placa de agar sangre disponible comercialmente (agar de soja tríptico suplementado con un 5% de sangre de oveja, ver Tabla de Materiales) con la bacteria.
   NOTA: Tam....

Discusión

Utilizando el protocolo descrito, se midió y visualizó la formación de biopelículas de aislados de Acinetobacter en diversos grados y se estimaron las células viables en las biopelículas (Figura 1, Figura 2 y Figura 3).

En este protocolo, se utilizaron dos temperaturas diferentes, 30 °C para el crecimiento y 25 °C para la formación de biopelículas de Acinetobacter. Se utilizó .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM