Estrategias de cuantificación, evaluación de viabilidad y visualización de biopelículas de Acinetobacter

Resumen

Este protocolo describe la preparación del inóculo, la cuantificación de la biopelícula en placas de microtitulación utilizando colorante violeta cristalino, el recuento viable en biopelículas y la visualización de biopelículas de Acinetobacter.

Resumen

Acinetobacter causa infecciones nosocomiales y su formación de biopelículas puede contribuir a la supervivencia en superficies secas como entornos hospitalarios. Por lo tanto, la cuantificación y visualización de biopelículas son métodos importantes para evaluar el potencial de las cepas de Acinetobacter para causar infecciones nosocomiales. Las biopelículas que se forman en la superficie de la microplaca se pueden cuantificar en términos de volumen y número de células. Los volúmenes de biopelícula se pueden cuantificar mediante tinción con violeta cristalino, lavado, decoloración con etanol y luego midiendo el colorante solubilizado con un lector de microplacas. Para cuantificar el número de células incrustadas en las biopelículas, las biopelículas se desechan utilizando raspadores celulares, se cosechan en la solución salina, se agitan vigorosamente en presencia de perlas de vidrio y se esparcen en agar Acinetobacter. A continuación, las placas se incuban a 30 °C durante 24-42 h. Después de la incubación, las colonias rojas se enumeran para estimar el número de células en las biopelículas. Este método de recuento viable también puede ser útil para contar células de Acinetobacter en biopelículas de especies mixtas. Las biopelículas de Acinetobacter se pueden visualizar utilizando tintes fluorescentes. Se emplea una microplaca disponible en el mercado diseñada para el análisis microscópico para formar biopelículas. A continuación, las biopelículas adheridas a la superficie inferior se tiñen con colorantes de yoduro de propidio y SYTO9, se lavan y luego se visualizan con microscopía de barrido láser confocal.

Introducción

Se sabe que Acinetobacter causa infecciones nosocomiales, y su infección en humanos, especialmente en centros de salud, se reporta cada vez más¹. Está muy extendido en hospitales, centros de salud y entornos asociados a los alimentos ^2,3,4. Puede sobrevivir durante un largo período en entornos que incluyen superficies hospitalarias como barandillas de camas, mesitas de noche, la superficie de ventiladores y lavabos⁴. Tal persistencia en las superficies ambientales puede ser uno de los factores significativos que contribuyen a las infecciones nosocomiales de Acinetobacter⁴.

El biofilm es una forma de vida microbiana y es una matriz microbiana compuesta por células microbianas vivas y sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de las células⁵. Las células microbianas están incrustadas en la matriz y, a menudo, son altamente resistentes a las tensiones ambientales como el calor, las sales, la sequedad, los antibióticos, los desinfectantes y las fuerzas de cizallamiento ^6,7.

Acinetobacter puede formar biopelículas en las superficies, lo que sugiere que puede contribuir a una mayor supervivencia en las superficies ambientales, incluidas las superficies hospitalarias, y a una mayor resistencia al tratamiento con antibióticos ^8,9. Además, la formación de biopelículas de Acinetobacter podría estar altamente asociada con los resultados clínicos humanos⁸. Por lo tanto, la formabilidad de la biopelícula de las cepas de Acinetobacter podría ser uno de los indicadores en la predicción de la supervivencia ambiental y de las infecciones humanas ^8,10.

Las biopelículas adheridas a la superficie se pueden cuantificar y visualizar para evaluar la formabilidad de la biopelícula. Para cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, las biopelículas normalmente se tiñen con colorantes que tiñen la biopelícula, como el violeta cristalino, y los colorantes se eluyen en solución y se mide la densidad óptica¹¹. La visualización de biopelículas es otro buen enfoque para evaluar la conformabilidad de las biopelículas¹¹. El método de visualización de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) que emplea especificidad utilizando colorantes fluorescentes podría ser más útil para caracterizar la morfología de la biopelícula en comparación con otras técnicas como SEM^12,13.

Las células viables en las biopelículas se pueden contar para estimar el número de células viables en las biopelículas¹¹. Las células viables incrustadas en las biopelículas se desprenden, se diluyen, se esparcen en placas de agar, se incuban y se enumeran. Debido a que es probable que el mayor número de células cumpla con la dosis infecciosa, puede proporcionar información más detallada sobre las biopelículas, como los potenciales de infección asociados con el número de células^13,14.

Este artículo presenta protocolos paso a paso para (1) cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, (2) contar las células viables en las biopelículas y (3) visualizar las biopelículas utilizando CLSM de Acinetobacter. Los protocolos presentados describen los métodos para evaluar la conformabilidad de las biopelículas de los aislados de Acinetobacter y caracterizar sus biopelículas.

Protocolo

1. Preparación del inóculo bacteriano

1. Retire el vial de caldo de glicerol almacenado a -80 °C.
2. Retire la cepa bacteriana (2-10 μL) del vial con una punta de pipeta estéril.
   NOTA: En este protocolo se utilizan cepas de Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) y A. ursingii (24-1).
3. Inocular una placa de agar sangre disponible comercialmente (agar de soja tríptico suplementado con un 5% de sangre de oveja, ver Tabla de Materiales) con la bacteria.
   NOTA: También se pueden utilizar otros medios, como agar nutriente o agar MacConkey.
4. Raye la superficie del agar usando un asa estéril con flameado intermitente para diluirla.
5. Coloque la placa de agar boca abajo en una incubadora e incube a 30 °C durante la noche durante 20-24 h.
6. Escoja una sola colonia del cultivo bacteriano con una aguja estéril e inocule 5 ml de caldo estéril de infusión cerebro-corazón (BHI, ver Tabla de materiales) con el cultivo.
7. Incubar el caldo inoculado en una incubadora agitadora a 30 °C durante la noche durante 20-24 h a unas 150 rpm.
8. Transfiera 1 ml del cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga estéril y centrifugue el cultivo nocturno a 6.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
9. Retire el sobrenadante con una pipeta.
10. Con un vórtice, vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
11. Centrifugar a 6.000 × g durante 10 min a RT y retirar el sobrenadante.
12. Vuelva a suspender el gránulo en BHI estéril diez veces diluido utilizando vórtice hasta una densidad óptica de alrededor de 0,1 a 600 nm.
    NOTA: La densidad óptica de alrededor de 0,1 equivale aproximadamente a 10⁷ UFC/ml.

2. Cuantificación de biopelículas mediante cristal violeta

1. Agregue 200 μL de inóculo a cada pocillo de una placa estéril de poliestireno de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales) y agregue 200 μL de agua desionizada a cada uno de los pocillos más externos para evitar que los pocillos internos se sequen¹⁵.
2. Agregue 200 μL de BHI diluido diez veces a cada pocillo de la misma placa como control negativo.
3. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h.
4. Retire el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: La pipeta multicanal suele ser más conveniente para varias muestras.
5. Agregue con cuidado 300 μL de PBS a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: La pipeta multicanal suele ser más conveniente para varias muestras.
6. Repita el paso 2.5 dos veces más.
7. Añadir 200 μL de solución de violeta cristalina (1%) (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo e incubar a RT durante 30 min.
8. Repita los pasos 2.4-2.6.
9. Agregue 200 μL de etanol absoluto a cada pocillo e incube durante 15 minutos a RT. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
10. Transfiera 100 μL de elución de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos.
11. Mida la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas (consulte la tabla de materiales).
12. Cuando la absorbancia sea superior a 2,0, se debe diluir adecuadamente la muestra hasta alcanzar una absorbancia inferior a 2,0 en etanol absoluto y se debe medir como se indica en el paso 2.11. A continuación, calcule la absorbancia de la muestra (valor final) multiplicando el valor observado por el factor de dilución.
13. Calcule la absorbancia real de las muestras restando el valor promedio del control negativo del valor de cada pocillo de las muestras de prueba en la misma placa de pocillo.

3. Recuento de viabilidad de la biopelícula

1. Agregue 1 mL de inóculo (paso 1) a cada pocillo de una placa estéril de poliestireno de 12 pocillos¹⁵. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h. Retire el sobrenadante con una pipeta.
2. Agregue con cuidado 1,5 ml de PBS estéril a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta. Agregue 1 ml de PBS estéril a cada pocillo.
3. Raspe el fondo y las superficies de la pared del pozo con raspadores de celdas instalados.
4. Transfiera la suspensión celular recolectada a un tubo de plástico estéril (10-1) que contenga 9 ml de solución salina (0,85% de NaCl) y ^10-20 perlas de vidrio (consulte la tabla de materiales).
   NOTA: Para recoger cualquier residuo de biopelícula que quede en la superficie inferior del pozo, se puede resuspender y transferir con una pipeta utilizando solución salina del tubo ^10-1 .
5. Agite el tubo ^10-1 durante 60 s a una velocidad máxima.
6. Realice una dilución seriada de 10 veces transfiriendo 1 mL al siguiente tubo estéril (10-2) que contenga 9 mL de solución salina (0,85 % NaCl) hasta ^10-7.
7. Esparcir 100 μL de cada dilución en agar Acinetobacter (ver Tabla de Materiales) e incubar las placas de agar a 30 °C durante 24-42 h.
8. Cuente manualmente el número de colonias rojas típicas en cada plato en el rango entre 10 y 250.
9. Calcule el número de células viables en la biopelícula de cada pocillo utilizando la siguiente ecuación:
   Células viables = Número de colonias × Factores de dilución × 10

4. Visualización de biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM)

1. Añadir 200 μL de inóculo a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos destinada al análisis microscópico.
2. Incubar la placa a 25 °C durante 24 h.
3. Retire el sobrenadante con una pipeta.
4. Agregue con cuidado 300 μL de agua desionizada esterilizada con filtro a cada pocillo y retire el sobrenadante con una pipeta.
5. Repita el paso 4.4.
6. Preparar la mezcla de SYTO 9 y yoduro de propidio (ver Tabla de Materiales) diluida en agua desionizada esterilizada por filtro hasta una concentración final de 10 μM y 60 μM, respectivamente.
7. Agregue la mezcla a cada pocillo a 200 μL e incube la placa durante 20-30 min a RT en la oscuridad.
8. Repita los pasos 4.3-4.4
9. Visualice las biopelículas adheridas a la superficie inferior utilizando CLSM con la longitud de onda de excitación de 488 nm y 561 nm y el rango de longitud de onda de emisión de 499-535 nm y 568-712 nm, respectivamente.

Resultados

Siguiendo el protocolo, las biopelículas de aislados de Acinetobacter , originalmente aisladas de las superficies de la cocina, se formaron en una placa de poliestireno de 96 pocillos, teñida con violeta cristalino, y los colorantes se solubilizaron en etanol y se midió la masa de la biopelícula (Figura 1). El número de biopelículas varió mucho en función de las cepas, oscilando entre 0,04 y 1,69 DO (Figura 1). Con base en los criterios establec...

Discusión

Utilizando el protocolo descrito, se midió y visualizó la formación de biopelículas de aislados de Acinetobacter en diversos grados y se estimaron las células viables en las biopelículas (Figura 1, Figura 2 y Figura 3).

En este protocolo, se utilizaron dos temperaturas diferentes, 30 °C para el crecimiento y 25 °C para la formación de biopelículas de Acinetobacter. Se utilizó ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM