Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

요약

이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.

초록

아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키며 생물막 형성은 병원 환경과 같은 건조한 표면에서 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 생물막 정량화 및 시각화는 아시네토박터 균주가 병원 내 감염을 일으킬 가능성을 평가하는 중요한 방법입니다. 마이크로플레이트 표면에 형성되는 생물막은 부피와 세포 수 측면에서 정량화할 수 있습니다. 생물막 부피는 크리스탈 바이올을 사용하여 염색하고, 세척하고, 에탄올을 사용하여 탈염한 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가용화된 염료를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 생물막에 묻힌 세포의 수를 정량화하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 생물막을 긁어내고, 식염수에서 수확하고, 유리 구슬의 존재 하에서 격렬하게 교반하고, 아시네토박터 한천에 퍼뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다. 배양 후에, 빨간 식민지는 biofilms에 있는 세포의 수를 추정하기 위하여 열거됩니다. 이 실행 가능한 계수 방법은 혼합 종 생물막에서 아시네토박터 세포를 계수하는 데에도 유용할 수 있습니다. 아시네토박터 생물막은 형광 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현미경 분석을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트는 생물막을 형성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 바닥 표면에 부착된 생물막을 SYTO9 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색하고 세척한 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화합니다.

서문

아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 특히 의료 시설에서 인체 감염이 점점 더 많이 보고되고 있습니다¹. 병원, 의료 시설 및 식품 관련 환경에 널리 퍼져 있습니다 ^2,3,4. 침대 레일, 침대 옆 탁자, 인공 호흡기 표면 및 싱크대와 같은 병원 표면을 포함한 환경에서 장기간 생존할 수 있습니다⁴. 환경 표면에서의 이러한 지속성은 아시네토박터⁴의 병원 감염에 기여하는 중요한 요인 중 하나일 수 있습니다.

생물막은 미생물 생명체의 한 형태이며 살아있는 미생물 세포와 세포의 세포외 고분자 물질(EPS)로 구성된 미생물 매트릭스입니다⁵. 미생물 세포는 매트릭스에 내장되어 있으며 종종 열, 염분, 건조, 항생제, 소독제 및 전단력과 같은 환경 스트레스에 매우 강합니다 ^6,7

프로토콜

1. 세균 접종물의 제조

1. -80°C에서 보관된 글리세롤 스톡 바이알을 제거합니다.
2. 멸균 피펫 팁을 사용하여 바이알에서 박테리아 균주(2-10 μL)를 제거합니다.
   참고: 이 프로토콜에는 아시네토박터 균주, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) 및 A. ursingii (24-1)가 사용됩니다.
3. 시판되는 혈액 한천 플레이트(5% 양의 혈액이 보충된 트립틱 대두 한천, 재료 표 참조)에 박테리아를 접종합니다.
   알림: 영양 한천 또는 MacConkey 한천과 같은 다른 매체도 사용할 수 있습니다.
4. 간헐적으로 연소되는 멸균 루프를 사용하여 한천 표면을 줄무늬로 만들어 얇게 만듭니다.
5. 한천 플레이트를 인큐베이터에 거꾸로 놓고 30°C에서 밤새 20-24시간 동안 배양합니다.
6. 멸균 바늘로 박테리아 배양액의 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 멸균 뇌 심장 주입액(B....

토론

기술된 프로토콜을 사용하여, 다양한 정도의 아시네토박터 분리물의 생물막 형성을 측정하고, 시각화하고, 생물막에서 생존 가능한 세포를 추정하였다(도 1, 도 2 및 도 3).

이 프로토콜에서는 성장을 위한 30°C와 아시네토박터의 생물막 형성을 위한 25°C의 두 가지 다른 온도를 사용했습니다. 많?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM