Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

Resumo

Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.

Resumo

Acinetobacter causa infecções hospitalares e sua formação de biofilme pode contribuir para a sobrevivência em superfícies secas, como ambientes hospitalares. Assim, a quantificação e visualização do biofilme são métodos importantes para avaliar o potencial de cepas de Acinetobacter em causar infecções nosocomiais. Os biofilmes que se formam na superfície da microplaca podem ser quantificados em termos de volume e número de células. Os volumes de biofilme podem ser quantificados pela coloração usando violeta de cristal, lavagem, coloração usando etanol e, em seguida, medindo o corante solubilizado usando um leitor de microplacas. Para quantificar o número de células embutidas nos biofilmes, os biofilmes são descartados com raspadores celulares, colhidos em solução salina, agitados vigorosamente na presença de esferas de vidro e espalhados em ágar Acinetobacter. Em seguida, as placas são incubadas a 30 °C por 24-42 h. Após a incubação, as colônias vermelhas são enumeradas para estimar o número de células em biofilmes. Este método de contagem viável também pode ser útil para a contagem de células de Acinetobacter em biofilmes de espécies mistas. Biofilmes de Acinetobacter podem ser visualizados usando corantes fluorescentes. Uma microplaca comercialmente disponível projetada para análise microscópica é empregada para formar biofilmes. Em seguida, os biofilmes aderidos à superfície inferior são corados com SYTO9 e iodeto de propídio, lavados e, em seguida, visualizados com microscopia confocal de varredura a laser.

Introdução

Sabe-se que a Acinetobacter causa infecções nosocomiais é cada vez mais relatada¹. Está disseminada em hospitais, serviços de saúde e ambientes associados à alimentação ^2,3,4. Pode sobreviver por um longo período em ambientes que incluem superfícies hospitalares, como grades de cama, mesas de cabeceira, superfície de ventiladores e pias⁴. Essa persistência nas superfícies ambientais pode ser um dos fatores significativos que contribuem para as infecções nosocomiais de Acinetobacter⁴.

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Protocolo

1. Preparação do inóculo bacteriano

1. Retire o frasco para injetáveis de glicerol armazenado a -80 °C.
2. Retire a estirpe bacteriana (2-10 μL) do frasco para injetáveis utilizando uma ponta de pipeta estéril.
   NOTA: Cepas de Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1) são utilizadas neste protocolo.
3. Inocular uma placa de ágar sangue comercialmente disponível (ágar de soja tríptico suplementado com 5% de sangue de carneiro, ver Tabela de Materiais

Discussão

Usando o protocolo descrito, a formação de biofilme de isolados de Acinetobacter com graus variados foi medida, visualizada e as células viáveis nos biofilmes foram estimadas (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).

Neste protocolo, foram utilizadas duas diferentes temperaturas, 30 °C para o crescimento e 25 °C para a formação do biofilme de Acinetobacter. 30 °C foi utilizado porque mui.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM