Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

Resumo

Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.

Resumo

Acinetobacter causa infecções hospitalares e sua formação de biofilme pode contribuir para a sobrevivência em superfícies secas, como ambientes hospitalares. Assim, a quantificação e visualização do biofilme são métodos importantes para avaliar o potencial de cepas de Acinetobacter em causar infecções nosocomiais. Os biofilmes que se formam na superfície da microplaca podem ser quantificados em termos de volume e número de células. Os volumes de biofilme podem ser quantificados pela coloração usando violeta de cristal, lavagem, coloração usando etanol e, em seguida, medindo o corante solubilizado usando um leitor de microplacas. Para quantificar o número de células embutidas nos biofilmes, os biofilmes são descartados com raspadores celulares, colhidos em solução salina, agitados vigorosamente na presença de esferas de vidro e espalhados em ágar Acinetobacter. Em seguida, as placas são incubadas a 30 °C por 24-42 h. Após a incubação, as colônias vermelhas são enumeradas para estimar o número de células em biofilmes. Este método de contagem viável também pode ser útil para a contagem de células de Acinetobacter em biofilmes de espécies mistas. Biofilmes de Acinetobacter podem ser visualizados usando corantes fluorescentes. Uma microplaca comercialmente disponível projetada para análise microscópica é empregada para formar biofilmes. Em seguida, os biofilmes aderidos à superfície inferior são corados com SYTO9 e iodeto de propídio, lavados e, em seguida, visualizados com microscopia confocal de varredura a laser.

Introdução

Sabe-se que a Acinetobacter causa infecções nosocomiais é cada vez mais relatada¹. Está disseminada em hospitais, serviços de saúde e ambientes associados à alimentação ^2,3,4. Pode sobreviver por um longo período em ambientes que incluem superfícies hospitalares, como grades de cama, mesas de cabeceira, superfície de ventiladores e pias⁴. Essa persistência nas superfícies ambientais pode ser um dos fatores significativos que contribuem para as infecções nosocomiais de Acinetobacter⁴.

O biofilme é uma forma de vida microbiana e é uma matriz microbiana composta por células microbianas vivas e substâncias poliméricas extracelulares (EPS) provenientes das células⁵. As células microbianas estão embutidas na matriz e são frequentemente altamente resistentes a estresses ambientais como calor, sais, secura, antibióticos, desinfetantes e forças de cisalhamento ^6,7.

Acinetobacter pode formar biofilmes em superfícies, sugerindo que pode contribuir para maior sobrevida em superfícies ambientais, incluindo superfícies hospitalares, e maior resistência ao tratamento com antibióticos ^8,9. Além disso, a formação de biofilme de Acinetobacter poderia estar altamente associada a desfechos clínicos humanos⁸. Portanto, a formabilidade do biofilme de cepas de Acinetobacter pode ser um dos indicadores na predição de sobrevivência ambiental e infecções humanas ^8,10.

Os biofilmes aderidos à superfície podem ser quantificados e visualizados para avaliar a formabilidade do biofilme. Para quantificar os biofilmes aderidos à superfície, os biofilmes são normalmente corados por corantes corantes de biofilme, como o violeta de cristal, e os corantes são eluídos em solução e medidos quanto à densidade óptica¹¹. A visualização de biofilmes é outra boa abordagem para avaliar a conformabilidade do biofilme¹¹. O método de visualização por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) empregando especificidade usando corantes fluorescentes poderia ser mais útil para caracterizar a morfologia do biofilme em comparação com outras técnicas, como a^MEV12,13.

As células viáveis em biofilmes podem ser contadas para estimar o número de células viáveis em biofilmes¹¹. As células viáveis embutidas em biofilmes são destacadas, diluídas, espalhadas em placas de ágar, incubadas e enumeradas. Como o maior número de células provavelmente atenderá à dose infecciosa, ele pode fornecer informações mais detalhadas sobre os biofilmes, como os potenciais de infecção associados ao número de células^13,14.

Este artigo apresenta protocolos passo a passo para (1) quantificar biofilmes aderidos à superfície, (2) contar células viáveis nos biofilmes e (3) visualizar os biofilmes usando CLSM de Acinetobacter. Os protocolos apresentados descrevem os métodos para avaliar a conformabilidade do biofilme de isolados de Acinetobacter e caracterizar seus biofilmes.

Protocolo

1. Preparação do inóculo bacteriano

1. Retire o frasco para injetáveis de glicerol armazenado a -80 °C.
2. Retire a estirpe bacteriana (2-10 μL) do frasco para injetáveis utilizando uma ponta de pipeta estéril.
   NOTA: Cepas de Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1) são utilizadas neste protocolo.
3. Inocular uma placa de ágar sangue comercialmente disponível (ágar de soja tríptico suplementado com 5% de sangue de carneiro, ver Tabela de Materiais) com as bactérias.
   NOTA: Outros meios, como ágar nutriente ou ágar MacConkey, também podem ser usados.
4. Estrie a superfície do ágar usando uma alça estéril com chamas intermitentes para afiná-la.
5. Coloque a placa de ágar de cabeça para baixo em uma incubadora e incube a 30 °C durante a noite por 20-24 h.
6. Escolha uma única colônia da cultura bacteriana com uma agulha estéril e inocular 5 mL de caldo de infusão cerebral cerebral estéril (BHI, ver Tabela de Materiais) com a cultura.
7. Incubar o caldo inoculado numa incubadora de agitação a 30 °C durante a noite durante 20-24 h a cerca de 150 rpm.
8. Transferir 1 mL da cultura noturna para um tubo de microcentrífuga estéril e centrifugar a cultura noturna a 6.000 × g por 10 min à temperatura ambiente (TR).
9. Retire o sobrenadante com uma pipeta.
10. Usando um vórtice, ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
11. Centrifugar a 6.000 × g por 10 min em RT e remover o sobrenadante.
12. Ressuspender o pellet em BHI estéril dez vezes diluído usando vórtice para uma densidade óptica de cerca de 0,1 a 600 nm.
    NOTA: A densidade óptica de cerca de 0,1 é equivalente a aproximadamente 10⁷ UFC/mL.

2. Quantificação do biofilme utilizando cristal violeta

1. Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 96 poços (ver Tabela de Materiais) e adicionar 200 μL de água deionizada a cada um dos poços mais externos para evitar que os poços internos sequem¹⁵.
2. Adicionar 200 μL de BHI diluído dez vezes a cada poço da mesma placa como controle negativo.
3. Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.
4. Retire o sobrenadante com uma pipeta.
   NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras.
5. Adicione cuidadosamente 300 μL de PBS a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta.
   NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras.
6. Repita a etapa 2.5 mais duas vezes.
7. Adicionar 200 μL de solução de cristal violeta (1%) (ver Tabela de Materiais) a cada poço e incubar em RT durante 30 minutos.
8. Repita as etapas 2.4-2.6.
9. Adicione 200 μL de etanol absoluto a cada poço e incube por 15 min em RT. Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes.
10. Transfira a eluição de 100 μL de cada poço para uma nova placa de 96 poços.
11. Medir a absorbância a 595 nm utilizando um leitor de microplacas (ver Tabela de Materiais).
12. Quando a absorbância exceder 2,0, fazer uma diluição adequada da amostra para a absorvância inferior a 2,0 em etanol absoluto e medi-la como na etapa 2.11. Em seguida, calcule a absorbância da amostra (valor final) multiplicando o valor observado pelo fator de diluição.
13. Calcular a verdadeira absorbância das amostras subtraindo o valor médio do controlo negativo do valor de cada poço das amostras de ensaio na mesma placa de poço.

3. Contagem de viabilidade do biofilme

1. Adicionar 1 mL de inóculo (passo 1) a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 12 poços¹⁵. Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas. Retire o sobrenadante com uma pipeta.
2. Adicione cuidadosamente 1,5 mL de PBS estéril a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicionar 1 mL de PBS estéril a cada poço.
3. Raspe as superfícies do fundo e da parede do poço usando raspadores de células adaptados.
4. Transferir a suspensão celular colhida para um tubo plástico estéril (10-1) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) e ^10-20 esferas de vidro (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para coletar qualquer resíduo residual de biofilme deixado na superfície inferior do poço, ele pode ser ressuspendido e transferido por pipeta usando soro fisiológico do tubo ^10-1 .
5. Vórtice o tubo ^10-1 por 60 s em uma velocidade máxima.
6. Fazer uma diluição seriada de 10 vezes transferindo 1 mL para o próximo tubo estéril (10-2) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) até ^10-7.
7. Espalhe 100 μL de cada diluição em ágar Acinetobacter (ver Tabela de Materiais) e incube as placas de ágar a 30 °C durante 24-42 horas.
8. Conte manualmente o número das colônias vermelhas típicas em cada placa no intervalo entre 10 e 250.
9. Calcule o número de células viáveis no biofilme de cada poço utilizando a equação abaixo:
   Células viáveis = Número de colônias × Fatores de diluição × 10

4. Visualização do biofilme por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)

1. Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de 96 poços destinada à análise microscópica.
2. Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.
3. Retire o sobrenadante com uma pipeta.
4. Adicione cuidadosamente 300 μL de água deionizada esterilizada por filtro a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta.
5. Repita a etapa 4.4.
6. Preparar a mistura de SYTO 9 e iodeto de propídio (ver Tabela de Materiais) diluída em água deionizada esterilizada por filtro até uma concentração final de 10 μM e 60 μM, respectivamente.
7. Adicione a mistura a cada poço a 200 μL e incube a placa por 20-30 min em TR no escuro.
8. Repita as etapas 4.3-4.4
9. Visualize os biofilmes acoplados à superfície inferior usando CLSM com comprimento de onda de excitação de 488 nm e 561 nm e a faixa de comprimento de onda de emissão de 499-535 nm e 568-712 nm, respectivamente.

Resultados

Seguindo o protocolo, os biofilmes dos isolados de Acinetobacter , originalmente isolados de superfícies de cozinha, foram formados em uma placa de poliestireno de 96 poços, corada com violeta de cristal, e os corantes foram solubilizados em etanol e medidos quanto à massa de biofilme (Figura 1). O número de biofilmes variou muito dependendo das cepas, variando de 0,04 a 1,69 DO (Figura 1). Com base nos critérios estabelecidos por Stepanović et

Discussão

Usando o protocolo descrito, a formação de biofilme de isolados de Acinetobacter com graus variados foi medida, visualizada e as células viáveis nos biofilmes foram estimadas (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).

Neste protocolo, foram utilizadas duas diferentes temperaturas, 30 °C para o crescimento e 25 °C para a formação do biofilme de Acinetobacter. 30 °C foi utilizado porque mui...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM