Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.

Zusammenfassung

Acinetobacter verursacht nosokomiale Infektionen und seine Biofilmbildung kann zum Überleben auf trockenen Oberflächen wie z.B. Krankenhausumgebungen beitragen. Daher sind Biofilmquantifizierung und -visualisierung wichtige Methoden, um das Potenzial von Acinetobacter-Stämmen zur Verursachung nosokomialer Infektionen zu bewerten. Die Biofilme, die sich auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte bilden, können in Bezug auf Volumen und Zellzahl quantifiziert werden. Biofilmvolumina können durch Färben mit Kristallviolett, Waschen, Entfärben mit Ethanol und anschließendes Messen des gelösten Farbstoffs mit einem Mikroplatten-Reader quantifiziert werden. Um die Anzahl der in die Biofilme eingebetteten Zellen zu quantifizieren, werden die Biofilme mit Hilfe von Zellschabern abgekratzt, in der Kochsalzlösung geerntet, in Gegenwart von Glasperlen kräftig gerührt und auf Acinetobacter-Agar verteilt. Anschließend werden die Platten bei 30 °C für 24-42 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die roten Kolonien gezählt, um die Anzahl der Zellen in Biofilmen abzuschätzen. Diese brauchbare Zählmethode kann auch für die Zählung von Acinetobacter-Zellen in Biofilmen mit gemischten Spezies nützlich sein. Acinetobacter-Biofilme können mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Eine kommerziell erhältliche Mikrotiterplatte, die für die mikroskopische Analyse entwickelt wurde, wird zur Bildung von Biofilmen verwendet. Anschließend werden die an der Unterseite befestigten Biofilme mit SYTO9- und Propidiumiodid-Farbstoffen gefärbt, gewaschen und dann mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert.

Einleitung

Es ist bekannt, dass Acinetobacter nosokomiale Infektionen verursacht, und über seine Infektion beim Menschen, insbesondere in Gesundheitseinrichtungen, wird zunehmend berichtet¹. Es ist in Krankenhäusern, Gesundheitseinrichtungen und lebensmittelnahen Umgebungen weit verbreitet ^2,3,4. Es kann über einen langen Zeitraum in Umgebungen wie Krankenhausoberflächen wie Bettgittern, Nachttischen, der Oberfläche von Beatmungsgeräten und Waschbecken überleben⁴. Eine solche Persistenz auf Umweltoberflächen könnte einer der signi....

Protokoll

1. Herstellung des bakteriellen Inokulums

1. Nehmen Sie die bei -80 °C gelagerte Durchstechflasche mit Glycerinvorrat heraus.
2. Entfernen Sie den Bakterienstamm (2-10 μl) mit einer sterilen Pipettenspitze aus der Durchstechflasche.
   HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Acinetobacter-Stämme A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) und A. ursingii (24-1) verwendet.
3. Eine handelsübliche Blutagarplatte (tryptischer Soja-Agar, ergänzt mit 5 % Schafsblut, siehe Materialtabelle) mit d....

Diskussion

Mit Hilfe des beschriebenen Protokolls wurde die Biofilmbildung von Acinetobacter-Isolaten in unterschiedlichem Ausmaß gemessen, visualisiert und die lebensfähigen Zellen in den Biofilmen geschätzt (Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3).

In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Temperaturen verwendet, 30 °C für das Wachstum und 25 °C für die Biofilmbildung von Acinetobacter

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM