Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.

Zusammenfassung

Acinetobacter verursacht nosokomiale Infektionen und seine Biofilmbildung kann zum Überleben auf trockenen Oberflächen wie z.B. Krankenhausumgebungen beitragen. Daher sind Biofilmquantifizierung und -visualisierung wichtige Methoden, um das Potenzial von Acinetobacter-Stämmen zur Verursachung nosokomialer Infektionen zu bewerten. Die Biofilme, die sich auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte bilden, können in Bezug auf Volumen und Zellzahl quantifiziert werden. Biofilmvolumina können durch Färben mit Kristallviolett, Waschen, Entfärben mit Ethanol und anschließendes Messen des gelösten Farbstoffs mit einem Mikroplatten-Reader quantifiziert werden. Um die Anzahl der in die Biofilme eingebetteten Zellen zu quantifizieren, werden die Biofilme mit Hilfe von Zellschabern abgekratzt, in der Kochsalzlösung geerntet, in Gegenwart von Glasperlen kräftig gerührt und auf Acinetobacter-Agar verteilt. Anschließend werden die Platten bei 30 °C für 24-42 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die roten Kolonien gezählt, um die Anzahl der Zellen in Biofilmen abzuschätzen. Diese brauchbare Zählmethode kann auch für die Zählung von Acinetobacter-Zellen in Biofilmen mit gemischten Spezies nützlich sein. Acinetobacter-Biofilme können mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Eine kommerziell erhältliche Mikrotiterplatte, die für die mikroskopische Analyse entwickelt wurde, wird zur Bildung von Biofilmen verwendet. Anschließend werden die an der Unterseite befestigten Biofilme mit SYTO9- und Propidiumiodid-Farbstoffen gefärbt, gewaschen und dann mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert.

Einleitung

Es ist bekannt, dass Acinetobacter nosokomiale Infektionen verursacht, und über seine Infektion beim Menschen, insbesondere in Gesundheitseinrichtungen, wird zunehmend berichtet¹. Es ist in Krankenhäusern, Gesundheitseinrichtungen und lebensmittelnahen Umgebungen weit verbreitet ^2,3,4. Es kann über einen langen Zeitraum in Umgebungen wie Krankenhausoberflächen wie Bettgittern, Nachttischen, der Oberfläche von Beatmungsgeräten und Waschbecken überleben⁴. Eine solche Persistenz auf Umweltoberflächen könnte einer der signifikanten Faktoren sein, die zu den nosokomialen Infektionen von Acinetobacter⁴ beitragen.

Biofilm ist eine Form des mikrobiellen Lebens und ist eine mikrobielle Matrix, die aus lebenden mikrobiellen Zellen und extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) aus den Zellen besteht⁵. Die mikrobiellen Zellen sind in die Matrix eingebettet und oft sehr widerstandsfähig gegen Umweltbelastungen wie Hitze, Salze, Trockenheit, Antibiotika, Desinfektionsmittel und Scherkräfte ^6,7.

Acinetobacter kann Biofilme auf Oberflächen bilden, was darauf hindeutet, dass es zu einem verlängerten Überleben auf Umweltoberflächen, einschließlich Krankenhausoberflächen, und zu einer erhöhten Resistenz gegen Antibiotikabehandlung beitragen kann ^8,9. Darüber hinaus könnte die Biofilmbildung von Acinetobacter in hohem Maße mit den klinischen Ergebnissen beim Menschen assoziiert sein⁸. Daher könnte die Biofilmformbarkeit von Acinetobacter-Stämmen einer der Indikatoren für die Vorhersage des Überlebens in der Umwelt und menschlicher Infektionen sein ^8,10.

Die oberflächengebundenen Biofilme können quantifiziert und visualisiert werden, um die Formbarkeit von Biofilmen zu beurteilen. Um oberflächengebundene Biofilme zu quantifizieren, werden die Biofilme normalerweise mit Biofilm-Färbefarbstoffen wie Kristallviolett gefärbt, und die Farbstoffe werden in Lösung eluiert und auf optische Dichte^{gemessen 11}. Die Visualisierung von Biofilmen ist ein weiterer guter Ansatz, um die Formbarkeit von Biofilmen zu beurteilen¹¹. Die Visualisierungsmethode der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), die Spezifität unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, könnte zur Charakterisierung der Biofilmmorphologie nützlicher sein als andere Techniken wie REM^12,13.

Die lebensfähigen Zellen in Biofilmen können gezählt werden, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Biofilmen abzuschätzen¹¹. Die lebensfähigen Zellen, die in Biofilme eingebettet sind, werden abgelöst, verdünnt, auf Agarplatten verteilt, inkubiert und gezählt. Da die höhere Anzahl von Zellen wahrscheinlich die infektiöse Dosis erfüllt, kann sie detailliertere Informationen über Biofilme liefern, wie z. B. Infektionspotenziale, die mit der Anzahl der Zellen assoziiert sind^13,14.

In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Protokolle vorgestellt, um (1) oberflächengebundene Biofilme zu quantifizieren, (2) lebensfähige Zellen in den Biofilmen zu zählen und (3) die Biofilme mit CLSM von Acinetobacter zu visualisieren. Die vorgestellten Protokolle beschreiben die Methoden zur Beurteilung der Biofilmformbarkeit von Acinetobacter-Isolaten und zur Charakterisierung ihrer Biofilme.

Protokoll

1. Herstellung des bakteriellen Inokulums

1. Nehmen Sie die bei -80 °C gelagerte Durchstechflasche mit Glycerinvorrat heraus.
2. Entfernen Sie den Bakterienstamm (2-10 μl) mit einer sterilen Pipettenspitze aus der Durchstechflasche.
   HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Acinetobacter-Stämme A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) und A. ursingii (24-1) verwendet.
3. Eine handelsübliche Blutagarplatte (tryptischer Soja-Agar, ergänzt mit 5 % Schafsblut, siehe Materialtabelle) mit den Bakterien beimpfen.
   HINWEIS: Andere Medien, wie z. B. Nähragar oder MacConkey-Agar, können ebenfalls verwendet werden.
4. Streichen Sie die Agaroberfläche mit einer sterilen Schlaufe mit intermittierendem Flammen ab, um sie zu verdünnen.
5. Die Agarplatte kopfüber in einen Inkubator legen und bei 30 °C über Nacht 20-24 h inkubieren.
6. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie der Bakterienkultur mit einer sterilen Nadel und beimpfen Sie 5 ml sterile Gehirnherz-Infusionsbrühe (BHI, siehe Materialtabelle) mit der Kultur.
7. Die inokulierte Brühe in einem Schüttelinkubator bei 30 °C über Nacht für 20-24 h bei ca. 150 U/min inkubieren.
8. 1 ml der Übernachtkultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführen und die Übernachtkultur bei 6.000 × g 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
9. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
10. Resuspendieren Sie das Pellet mit einem Wirbel in 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
11. Bei 6.000 × g für 10 min bei RT zentrifugieren und den Überstand entfernen.
12. Resuspendieren Sie das Pellet in sterilem, zehnfach verdünntem BHI unter Verwendung von Vortex auf eine optische Dichte von etwa 0,1 bei 600 nm.
    HINWEIS: Die optische Dichte von ca. 0,1 entspricht ca. 10⁷ KBE/ml.

2. Biofilm-Quantifizierung mit Kristallviolett

1. Geben Sie 200 μl Inokulum in jede Vertiefung einer sterilen Polystyrol-96-Well-Platte (siehe Materialtabelle) und fügen Sie 200 μl deionisiertes Wasser in jede der äußersten Vertiefungen hinzu, um ein Austrocknen der inneren Vertiefungen zu verhindern¹⁵.
2. Als Negativkontrolle werden 200 μl zehnfach verdünntes BHI in jede Vertiefung derselben Platte gegeben.
3. Die Platte 24 h bei 25 °C inkubieren.
4. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
   HINWEIS: Die Mehrkanalpipette ist oft bequemer für mehrere Proben.
5. Geben Sie vorsichtig 300 μl PBS in jede Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
   HINWEIS: Die Mehrkanalpipette ist oft bequemer für mehrere Proben.
6. Wiederholen Sie Schritt 2.5 noch zwei weitere Male.
7. In jede Vertiefung werden 200 μl kristallviolette Lösung (1 %) (siehe Materialtabelle) gegeben und 30 Minuten lang bei RT inkubiert.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 bis 2.6.
9. Geben Sie 200 μl absolutes Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei RT. Mischen Sie gründlich, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
10. Übertragen Sie 100 μl Elution aus jeder Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte.
11. Messen Sie die Extinktion bei 595 nm mit einem Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle).
12. Wenn die Extinktion 2,0 überschreitet, wird die Probe auf eine Absorption unter 2,0 in absolutem Ethanol verdünnt und wie in Schritt 2.11 gemessen. Berechnen Sie dann die Absorption der Probe (Endwert), indem Sie den beobachteten Wert mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren.
13. Berechnen Sie die tatsächliche Absorption der Proben, indem Sie den Durchschnittswert der Negativkontrolle vom Wert der einzelnen Vertiefungen der Testproben auf derselben Vertiefungsplatte subtrahieren.

3. Anzahl der Biofilm-Lebensfähigkeit

1. 1 ml Inokulum (Schritt 1) in jede Vertiefung einer sterilen 12-Well-Platte¹⁵ aus Polystyrol geben. Die Platte 24 h bei 25 °C inkubieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
2. Geben Sie vorsichtig 1,5 ml steriles PBS in jede Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Geben Sie 1 ml steriles PBS in jede Vertiefung.
3. Kratzen Sie die Boden- und Wandflächen des Brunnens mit montierten Zellschabern ab.
4. Die geerntete Zellsuspension wird in ein steriles Kunststoffröhrchen (10-1) überführt, das 9 ml Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) und ^10-20 Glasperlen enthält (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Um auf der Unterseite des Bohrlochs verbleibende Biofilmrückstände aufzufangen, können sie resuspendiert und durch Pipette mit Kochsalzlösung aus dem ^{10-1-Röhrchen} übertragen werden.
5. Die ^10-1-Röhre 60 s lang mit maximaler Geschwindigkeit vortexen.
6. Nehmen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung vor, indem Sie 1 ml in das nächste sterile Röhrchen (10-2) überführen, das 9 ml Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) bis zu ^10-7 enthält.
7. 100 μl aus jeder Verdünnung auf Acinetobacter-Agar verteilen (siehe Materialtabelle) und die Agarplatten bei 30 °C für 24-42 h inkubieren.
8. Zählen Sie die Anzahl der typischen roten Kolonien auf jeder Platte manuell im Bereich zwischen 10 und 250.
9. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen im Biofilm jedes Wells, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
   Lebensfähige Zellen = Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktoren × 10

4. Biofilm-Visualisierung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)

1. Geben Sie 200 μl Inokulum in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte, die für die mikroskopische Analyse bestimmt ist.
2. Die Platte 24 h bei 25 °C inkubieren.
3. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
4. Geben Sie vorsichtig 300 μl filtersterilisiertes deionisiertes Wasser in jede Vertiefung und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.4.
6. Das Gemisch aus SYTO 9 und Propidiumiodid (siehe Materialtabelle) wird in filtersterilisiertem deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration von 10 μM bzw. 60 μM verdünnt.
7. Geben Sie die Mischung in jede Vertiefung bei 200 μl und inkubieren Sie die Platte 20-30 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.4
9. Visualisieren Sie die an der Unterseite befestigten Biofilme mit CLSM mit der Anregungswellenlänge von 488 nm und 561 nm und dem Emissionswellenlängenbereich von 499-535 nm bzw. 568-712 nm.

Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll wurden die Biofilme von Acinetobacter-Isolaten , die ursprünglich aus Küchenoberflächen isoliert wurden, auf einer 96-Well-Polystyrolplatte gebildet, mit Kristallviolett gefärbt, und die Farbstoffe wurden in Ethanol gelöst und auf Biofilmmasse gemessen (Abbildung 1). Die Anzahl der Biofilme variierte je nach Stämmen stark und reichte von OD 0,04 bis 1,69 (Abbildung 1). Basierend auf den von Stepanović et ^al...

Diskussion

Mit Hilfe des beschriebenen Protokolls wurde die Biofilmbildung von Acinetobacter-Isolaten in unterschiedlichem Ausmaß gemessen, visualisiert und die lebensfähigen Zellen in den Biofilmen geschätzt (Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3).

In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Temperaturen verwendet, 30 °C für das Wachstum und 25 °C für die Biofilmbildung von Acinetobacter

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM