Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter

Résumé

Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.

Résumé

Acinetobacter provoque des infections nosocomiales et la formation de son biofilm peut contribuer à la survie sur des surfaces sèches telles que les environnements hospitaliers. Ainsi, la quantification et la visualisation du biofilm sont des méthodes importantes pour évaluer le potentiel des souches d’Acinetobacter à provoquer des infections nosocomiales. Les biofilms qui se forment à la surface de la microplaque peuvent être quantifiés en termes de volume et de nombre de cellules. Les volumes de biofilm peuvent être quantifiés par coloration à l’aide de violet cristallin, lavage, décoloration à l’éthanol, puis mesure du colorant solubilisé à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour quantifier le nombre de cellules incorporées dans les biofilms, les biofilms sont éliminés à l’aide de racleurs cellulaires, récoltés dans la solution saline, vigoureusement agités en présence de billes de verre et étalés sur gélose Acinetobacter. Ensuite, les plaques sont incubées à 30 °C pendant 24 à 42 h. Après incubation, les colonies rouges sont dénombrées pour estimer le nombre de cellules dans les biofilms. Cette méthode de comptage viable peut également être utile pour compter les cellules Acinetobacter dans les biofilms d’espèces mixtes. Les biofilms d’Acinetobacter peuvent être visualisés à l’aide de colorants fluorescents. Une microplaque disponible dans le commerce et conçue pour l’analyse microscopique est utilisée pour former des biofilms. Ensuite, les biofilms attachés à la surface inférieure sont colorés avec des colorants SYTO9 et à l’iodure de propidium, lavés, puis visualisés par microscopie confocale à balayage laser.

Introduction

Acinetobacter est connu pour provoquer des infections nosocomiales, et son infection humaine, en particulier dans les établissements de santé, est de plus en plus signalée¹. Il est répandu dans les hôpitaux, les établissements de santé et les environnements associés à l’alimentation ^2,3,4. Il peut survivre pendant une longue période dans des environnements tels que les surfaces hospitalières telles que les barrières de lit, les tables de chevet, la surface des ventilateurs et les éviers⁴. Une telle persistance sur les surfaces environnementales peut être l’un des facteurs importants contribuant aux infections nosocomiales d’Acinetobacter⁴.

Le biofilm est une forme de vie microbienne et est une matrice microbienne composée de cellules microbiennes vivantes et de substances polymères extracellulaires (EPS) provenant des cellules⁵. Les cellules microbiennes sont intégrées dans la matrice et sont souvent très résistantes aux stress environnementaux tels que la chaleur, les sels, la sécheresse, les antibiotiques, les désinfectants et les forces de cisaillement ^6,7.

Acinetobacter peut former des biofilms sur les surfaces, ce qui suggère qu’il peut contribuer à une survie prolongée sur les surfaces environnementales, y compris les surfaces hospitalières, et à une résistance accrue aux traitements antibiotiques ^8,9. De plus, la formation d’un biofilm d’Acinetobacter pourrait être fortement associée aux résultats cliniques chez l’homme⁸. Par conséquent, la formabilité du biofilm des souches d’Acinetobacter pourrait être l’un des indicateurs de prédiction de la survie environnementale et des infections humaines ^8,10.

Les biofilms attachés à la surface peuvent être quantifiés et visualisés pour évaluer la formabilité du biofilm. Pour quantifier les biofilms attachés à la surface, les biofilms sont normalement colorés par des colorants de coloration du biofilm tels que le violet cristallin, et les colorants sont élués en solution et mesurés pour la densité optique¹¹. La visualisation des biofilms est une autre bonne approche pour évaluer la formabilité des biofilms¹¹. La méthode de visualisation de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) utilisant la spécificité à l’aide de colorants fluorescents pourrait être plus utile pour caractériser la morphologie du biofilm par rapport à d’autres techniques telles que MEB^12,13.

Les cellules viables dans les biofilms peuvent être comptées pour estimer le nombre de cellules viables dans les biofilms¹¹. Les cellules viables intégrées dans les biofilms sont détachées, diluées, étalées sur des plaques de gélose, incubées et dénombrées. Étant donné que le nombre plus élevé de cellules est susceptible de répondre à la dose infectieuse, il peut fournir des informations plus détaillées sur les biofilms, tels que les potentiels d’infection associés au nombre de cellules^13,14.

Cet article présente des protocoles étape par étape pour (1) quantifier les biofilms attachés à la surface, (2) compter les cellules viables dans les biofilms et (3) visualiser les biofilms à l’aide du CLSM d’Acinetobacter. Les protocoles présentés décrivent les méthodes permettant d’évaluer la formabilité du biofilm des isolats d’Acinetobacter et de caractériser leurs biofilms.

Protocole

1. Préparation de l’inoculum bactérien

1. Retirez le flacon de glycérol stocké à -80 °C.
2. Retirez la souche bactérienne (2-10 μL) du flacon à l’aide d’un embout de pipette stérile.
   NOTA : Les souches d’Acinetobacter A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) et A. ursingii (24-1) sont utilisées dans ce protocole.
3. Inoculez la bactérie à une plaque de gélose au sang disponible dans le commerce (gélose tryptique au soja additionnée de 5 % de sang de mouton, voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : D’autres milieux, tels que la gélose nutritive ou la gélose MacConkey, peuvent également être utilisés.
4. Striez la surface de la gélose à l’aide d’une boucle stérile avec un flambage intermittent pour l’amincir.
5. Placez la plaque de gélose à l’envers dans un incubateur et incubez à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h.
6. Prélever une seule colonie de la culture bactérienne à l’aide d’une aiguille stérile et inoculer 5 ml de bouillon stérile pour perfusion de cerveau et de cœur (BHI, voir le tableau des matériaux) avec la culture.
7. Incuber le bouillon inoculé dans un incubateur à agitation à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h à environ 150 tr/min.
8. Transférez 1 mL de la culture de nuit dans un tube de microcentrifugation stérile et centrifugez la culture de nuit à 6 000 × g pendant 10 minutes à température ambiante (RT).
9. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
10. À l’aide d’un vortex, remettre le granulé en suspension dans 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
11. Centrifuger à 6 000 × g pendant 10 min à RT et retirer le surnageant.
12. Remettre en suspension la pastille dans un BHI stérile dix fois dilué à l’aide d’un vortex jusqu’à une densité optique d’environ 0,1 à 600 nm.
    REMARQUE : La densité optique d’environ 0,1 est équivalente à environ 10⁷ UFC/mL.

2. Quantification du biofilm à l’aide du violet cristallin

1. Ajouter 200 μL d’inoculum à chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 96 puits (voir le tableau des matériaux) et ajouter 200 μL d’eau déminéralisée à chacun des puits les plus à l’extérieur pour éviter que les puits intérieurs ne se dessèchent¹⁵.
2. Ajouter 200 μL de BHI dilué dix fois dans chaque puits de la même plaque comme témoin négatif.
3. Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.
4. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons.
5. Ajouter délicatement 300 μL de PBS dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons.
6. Répétez l’étape 2.5 deux fois de plus.
7. Ajouter 200 μL de solution cristalline violette (1 %) (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber à RT pendant 30 minutes.
8. Répétez les étapes 2.4 à 2.6.
9. Ajouter 200 μL d’éthanol absolu dans chaque puits et incuber pendant 15 min à RT. Bien mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
10. Transférez 100 μL d’élution de chaque puits vers une nouvelle plaque de 96 puits.
11. Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux).
12. Lorsque l’absorbance est supérieure à 2,0, diluer correctement l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit inférieur à 2,0 dans l’éthanol absolu et le mesurer comme à l’étape 2.11. Ensuite, calculez l’absorbance de l’échantillon (valeur finale) en multipliant la valeur observée par le facteur de dilution.
13. Calculer l’absorbance réelle des échantillons en soustrayant la valeur moyenne du témoin négatif de la valeur de chaque puits des échantillons d’essai sur la même plaque de puits.

3. Dénombrement de la viabilité du biofilm

1. Ajouter 1 mL d’inoculum (étape 1) dans chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 12 puits¹⁵. Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
2. Ajouter délicatement 1,5 mL de PBS stérile dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de PBS stérile dans chaque puits.
3. Grattez le fond et les parois du puits à l’aide de grattoirs à cellules ajustés.
4. Transférez la suspension cellulaire récoltée dans un tube en plastique stérile (^10-1) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) et 10 à 20 billes de verre (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Pour recueillir les débris résiduels du biofilm laissés sur la surface inférieure du puits, ils peuvent être remis en suspension et transférés à l’aide d’une pipette à l’aide d’une solution saline du tube ^10-1 .
5. Vortex le tube ^10-1 pendant 60 s à une vitesse maximale.
6. Effectuer une dilution en série 10 fois en transférant 1 mL dans le tube stérile suivant (10-2) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) jusqu’à ^10-7.
7. Étaler 100 μL de chaque dilution sur une gélose Acinetobacter (voir tableau des matériaux) et incuber les plaques de gélose à 30 °C pendant 24 à 42 h.
8. Comptez manuellement le nombre de colonies rouges typiques sur chaque plaque entre 10 et 250.
9. Calculez le nombre de cellules viables dans le biofilm de chaque puits à l’aide de l’équation ci-dessous :
   Cellules viables = Nombre de colonies × Facteurs de dilution × 10

4. Visualisation du biofilm à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)

1. Ajouter 200 μL d’inoculum dans chaque puits d’une plaque stérile à 96 puits destinée à l’analyse microscopique.
2. Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.
3. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.
4. Ajouter délicatement 300 μL d’eau déminéralisée stérilisée par filtre dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
5. Répétez l’étape 4.4.
6. Préparer le mélange de SYTO 9 et d’iodure de propidium (voir le tableau des matériaux) dilué dans de l’eau déminéralisée stérilisée par filtre jusqu’à une concentration finale de 10 μM et 60 μM, respectivement.
7. Ajouter le mélange dans chaque puits à 200 μL et incuber la plaque pendant 20-30 min à RT dans l’obscurité.
8. Répétez les étapes 4.3 et 4.4
9. Visualisez les biofilms attachés à la surface inférieure à l’aide de CLSM avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et 561 nm et une gamme de longueurs d’onde d’émission de 499 à 535 nm et de 568 à 712 nm, respectivement.

Résultats

Suivant le protocole, les biofilms d’isolats d’Acinetobacter, isolés à l’origine des surfaces de cuisine, ont été formés sur une plaque de polystyrène à 96 puits, colorée au violet cristallin, et les colorants ont été solubilisés dans de l’éthanol et mesurés pour la masse du biofilm (Figure 1). Le nombre de biofilms variait considérablement en fonction des souches, allant de 0,04 à 1,69 OD (Figure 1). Sur la base des critères ét...

Discussion

À l’aide du protocole décrit, la formation de biofilms d’isolats d’Acinetobacter à des degrés divers a été mesurée, visualisée et les cellules viables dans les biofilms ont été estimées (Figure 1, Figure 2 et Figure 3).

Dans ce protocole, deux températures différentes ont été utilisées, 30 °C pour la croissance et 25 °C pour la formation du biofilm d’Acinetobacter

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM