Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter

Résumé

Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.

Résumé

Acinetobacter provoque des infections nosocomiales et la formation de son biofilm peut contribuer à la survie sur des surfaces sèches telles que les environnements hospitaliers. Ainsi, la quantification et la visualisation du biofilm sont des méthodes importantes pour évaluer le potentiel des souches d’Acinetobacter à provoquer des infections nosocomiales. Les biofilms qui se forment à la surface de la microplaque peuvent être quantifiés en termes de volume et de nombre de cellules. Les volumes de biofilm peuvent être quantifiés par coloration à l’aide de violet cristallin, lavage, décoloration à l’éthanol, puis mesure du colorant solubilisé à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour quantifier le nombre de cellules incorporées dans les biofilms, les biofilms sont éliminés à l’aide de racleurs cellulaires, récoltés dans la solution saline, vigoureusement agités en présence de billes de verre et étalés sur gélose Acinetobacter. Ensuite, les plaques sont incubées à 30 °C pendant 24 à 42 h. Après incubation, les colonies rouges sont dénombrées pour estimer le nombre de cellules dans les biofilms. Cette méthode de comptage viable peut également être utile pour compter les cellules Acinetobacter dans les biofilms d’espèces mixtes. Les biofilms d’Acinetobacter peuvent être visualisés à l’aide de colorants fluorescents. Une microplaque disponible dans le commerce et conçue pour l’analyse microscopique est utilisée pour former des biofilms. Ensuite, les biofilms attachés à la surface inférieure sont colorés avec des colorants SYTO9 et à l’iodure de propidium, lavés, puis visualisés par microscopie confocale à balayage laser.

Introduction

Acinetobacter est connu pour provoquer des infections nosocomiales, et son infection humaine, en particulier dans les établissements de santé, est de plus en plus signalée¹. Il est répandu dans les hôpitaux, les établissements de santé et les environnements associés à l’alimentation ^2,3,4. Il peut survivre pendant une longue période dans des environnements tels que les surfaces hospitalières telles que les barrières de lit, les tables de chevet, la surface des ventilateurs et les éviers⁴. Une telle persistance sur les s....

Protocole

1. Préparation de l’inoculum bactérien

1. Retirez le flacon de glycérol stocké à -80 °C.
2. Retirez la souche bactérienne (2-10 μL) du flacon à l’aide d’un embout de pipette stérile.
   NOTA : Les souches d’Acinetobacter A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) et A. ursingii (24-1) sont utilisées dans ce protocole.
3. Inoculez la bactérie à une plaque de gélose au sang disponible dans le commerce (gélose tryptique au soja additionnée de 5 % de sang de mouton, voir le tableau des matériaux

Résultats

Suivant le protocole, les biofilms d’isolats d’Acinetobacter, isolés à l’origine des surfaces de cuisine, ont été formés sur une plaque de polystyrène à 96 puits, colorée au violet cristallin, et les colorants ont été solubilisés dans de l’éthanol et mesurés pour la masse du biofilm (Figure 1). Le nombre de biofilms variait considérablement en fonction des souches, allant de 0,04 à 1,69 OD (Figure 1). Sur la base des critères ét.......

Discussion

À l’aide du protocole décrit, la formation de biofilms d’isolats d’Acinetobacter à des degrés divers a été mesurée, visualisée et les cellules viables dans les biofilms ont été estimées (Figure 1, Figure 2 et Figure 3).

Dans ce protocole, deux températures différentes ont été utilisées, 30 °C pour la croissance et 25 °C pour la formation du biofilm d’Acinetobacter

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM