אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

Abstract

Acinetobacter גורם זיהומים nosocomial היווצרות biofilm שלה יכול לתרום להישרדות על משטחים יבשים כגון סביבות בית חולים. לפיכך, כימות ביופילם והדמיה הן שיטות חשובות להערכת הפוטנציאל של זני Acinetobacter לגרום לזיהומים nosocomial. ניתן לכמת את הביופילמים הנוצרים על פני השטח של המיקרו-צלחת במונחים של נפח ומספרי תאים. נפחי ביופילם ניתנים לכימות על ידי צביעה באמצעות סגול קריסטל, שטיפה, עיכוב באמצעות אתנול, ולאחר מכן מדידת הצבע המסיס באמצעות קורא microplate. כדי לכמת את מספר התאים המשובצים בביופילמים, מגרדים את הביופילמים באמצעות מגרדי תאים, קוצרים במי מלח, נסערים במרץ בנוכחות חרוזי זכוכית, ומפוזרים על אגר Acinetobacter. לאחר מכן, הצלחות מודגרות ב 30 ° C במשך 24-42 שעות. לאחר הדגירה, המושבות האדומות נמנות כדי להעריך את מספר התאים בביופילמים. שיטת ספירה בת קיימא זו יכולה להיות שימושית גם לספירת תאי Acinetobacter בביופילמים של מינים מעורבים. ניתן להמחיש ביופילמים של Acinetobacter באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. מיקרו-צלחת זמינה מסחרית המיועדת לניתוח מיקרוסקופי משמשת ליצירת ביופילמים. לאחר מכן, הביופילמים המחוברים לפני השטח התחתונים מוכתמים בצבעי יודיד SYTO9 ופרופידיום, נשטפים, ואז מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

Introduction

Acinetobacter ידוע לגרום זיהומים nosocomial, זיהום אנושי שלה, במיוחד במתקני בריאות, מדווח יותר ויותר¹. היא נפוצה בבתי חולים, מתקני בריאות וסביבות הקשורות למזון ^2,3,4. הוא יכול לשרוד תקופה ארוכה בסביבות הכוללות משטחי בית חולים כגון מעקות מיטה, שולחנות ליד המיטה, משטח של מכונות הנשמה וכיורים⁴. התמדה כזו על משטחים סביבתיים עשויה להיות אחד הגורמים המשמעותיים התורמים לזיהומים נוסוקומיאליים של Acinetobacter⁴.

ביופילם הוא צורה של חיים מיקרוביאליים והוא מטריצה מיקרובי....

Protocol

1. הכנת חיסון חיידקי

1. הסר את בקבוקון מלאי הגליצרול המאוחסן ב -80 ° C.
2. מוציאים את זן החיידק (2-10 μL) מהבקבוקון בעזרת קצה פיפטה סטרילי.
   הערה: זני Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ו- A. ursingii (24-1 ) משמשים בפרוטוקול זה.
3. יש לחסן צלחת אגר דם מסחרית (אגר סויה טריפטי בתוספת דם כבשים 5%, ראו טבלת חומרים) עם החיידקים.
   הערה: ניתן להשתמש גם במדיה אחרת, כגון אגר מזין או אגר MacConkey.
4. פזרו את משטח האגר באמצעות לולאה סטרילית עם להבה לסירוגין כדי ....

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, הביופילמים של Acinetobacter isolates, שבודדו במקור ממשטחי מטבח, נוצרו על צלחת פוליסטירן בעלת 96 בארות, מוכתמת בסגול קריסטל, והצבעים היו מסיסים באתנול ונמדדו למסת ביופילם (איור 1). מספר הביופילמים השתנה מאוד בהתאם לזנים שנעו בין OD 0.04 ל-1.69 (איור 1). בה.......

Discussion

באמצעות הפרוטוקול המתואר, היווצרות הביופילם של מבודדי Acinetobacter בדרגות שונות נמדדה, הודגמה, והוערכו התאים הקיימים בביופילמים (איור 1, איור 2 ואיור 3).

בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות צלזיוס לגידול ו-25 מע.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM