אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

Abstract

Acinetobacter גורם זיהומים nosocomial היווצרות biofilm שלה יכול לתרום להישרדות על משטחים יבשים כגון סביבות בית חולים. לפיכך, כימות ביופילם והדמיה הן שיטות חשובות להערכת הפוטנציאל של זני Acinetobacter לגרום לזיהומים nosocomial. ניתן לכמת את הביופילמים הנוצרים על פני השטח של המיקרו-צלחת במונחים של נפח ומספרי תאים. נפחי ביופילם ניתנים לכימות על ידי צביעה באמצעות סגול קריסטל, שטיפה, עיכוב באמצעות אתנול, ולאחר מכן מדידת הצבע המסיס באמצעות קורא microplate. כדי לכמת את מספר התאים המשובצים בביופילמים, מגרדים את הביופילמים באמצעות מגרדי תאים, קוצרים במי מלח, נסערים במרץ בנוכחות חרוזי זכוכית, ומפוזרים על אגר Acinetobacter. לאחר מכן, הצלחות מודגרות ב 30 ° C במשך 24-42 שעות. לאחר הדגירה, המושבות האדומות נמנות כדי להעריך את מספר התאים בביופילמים. שיטת ספירה בת קיימא זו יכולה להיות שימושית גם לספירת תאי Acinetobacter בביופילמים של מינים מעורבים. ניתן להמחיש ביופילמים של Acinetobacter באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. מיקרו-צלחת זמינה מסחרית המיועדת לניתוח מיקרוסקופי משמשת ליצירת ביופילמים. לאחר מכן, הביופילמים המחוברים לפני השטח התחתונים מוכתמים בצבעי יודיד SYTO9 ופרופידיום, נשטפים, ואז מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

Introduction

Acinetobacter ידוע לגרום זיהומים nosocomial, זיהום אנושי שלה, במיוחד במתקני בריאות, מדווח יותר ויותר¹. היא נפוצה בבתי חולים, מתקני בריאות וסביבות הקשורות למזון ^2,3,4. הוא יכול לשרוד תקופה ארוכה בסביבות הכוללות משטחי בית חולים כגון מעקות מיטה, שולחנות ליד המיטה, משטח של מכונות הנשמה וכיורים⁴. התמדה כזו על משטחים סביבתיים עשויה להיות אחד הגורמים המשמעותיים התורמים לזיהומים נוסוקומיאליים של Acinetobacter⁴.

ביופילם הוא צורה של חיים מיקרוביאליים והוא מטריצה מיקרוביאלית המורכבת מתאים מיקרוביאליים חיים וחומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS) מהתאים⁵. התאים המיקרוביאליים מוטמעים במטריצה ולעתים קרובות עמידים מאוד לעקות סביבתיות כגון חום, מלחים, יובש, אנטיביוטיקה, חומרי חיטוי וכוחות גזירה ^6,7.

Acinetobacter יכול ליצור ביופילמים על משטחים, דבר המצביע על כך שהוא עשוי לתרום להישרדות ממושכת על משטחים סביבתיים, כולל משטחי בתי חולים, ועמידות משופרת לטיפול אנטיביוטי ^8,9. בנוסף, היווצרות ביופילם של Acinetobacter יכול להיות קשור מאוד עם תוצאות קליניות אנושיות⁸. לכן, היווצרות הביופילם של זני Acinetobacter יכולה להיות אחד המדדים בניבוי הישרדות סביבתית וזיהומים אנושיים ^8,10.

ניתן לכמת ולהמחיש את הביופילמים המחוברים לפני השטח כדי להעריך את היווצרות הביופילם. כדי לכמת ביופילמים המחוברים לפני השטח, הביופילמים מוכתמים בדרך כלל על ידי צבעים מכתימי ביופילם כגון סגול גבישי, והצבעים מדוללים בתמיסה ונמדדים עבור צפיפות אופטית¹¹. הדמיה של ביופילמים היא גישה טובה נוספת להערכת היווצרות ביופילם¹¹. שיטת הדמיה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) המשתמשת בספציפיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים יכולה להיות שימושית יותר לאפיון מורפולוגיית ביופילם בהשוואה לטכניקות אחרות כגון SEM^12,13.

ניתן לספור את התאים הקיימים בביופילמים כדי להעריך את מספר התאים הקיימים בביופילמים¹¹. התאים בני הקיימא המשובצים בביופילמים מנותקים, מדוללים, מפוזרים על לוחות אגר, מודגרים וממוספרים. מכיוון שמספר התאים הגבוה יותר צפוי לעמוד במינון הזיהומי, הוא יכול לספק מידע מפורט יותר על ביופילמים, כגון פוטנציאלי זיהום הקשורים למספר התאים^13,14.

מאמר זה מציג פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי (1) לכמת ביופילמים המחוברים לפני השטח, (2) לספור תאים ברי קיימא בביופילמים, ו-(3) לדמיין את הביופילמים באמצעות CLSM של Acinetobacter. הפרוטוקולים המוצגים מתארים את השיטות להעריך את כושר הביופילם של מבודדי Acinetobacter ולאפיין את הביופילמים שלהם.

Protocol

1. הכנת חיסון חיידקי

1. הסר את בקבוקון מלאי הגליצרול המאוחסן ב -80 ° C.
2. מוציאים את זן החיידק (2-10 μL) מהבקבוקון בעזרת קצה פיפטה סטרילי.
   הערה: זני Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ו- A. ursingii (24-1 ) משמשים בפרוטוקול זה.
3. יש לחסן צלחת אגר דם מסחרית (אגר סויה טריפטי בתוספת דם כבשים 5%, ראו טבלת חומרים) עם החיידקים.
   הערה: ניתן להשתמש גם במדיה אחרת, כגון אגר מזין או אגר MacConkey.
4. פזרו את משטח האגר באמצעות לולאה סטרילית עם להבה לסירוגין כדי לדלל אותו.
5. מניחים את צלחת האגר הפוכה באינקובטור ודגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך לילה למשך 20-24 שעות.
6. בחר מושבה אחת של תרבית חיידקים עם מחט סטרילית וחסן 5 מ"ל סטרילי של מרק עירוי לב במוח (BHI, ראה טבלת חומרים) עם התרבית.
7. לדגור על המרק המחוסן באינקובטור רועד ב 30 מעלות צלזיוס במשך הלילה במשך 20-24 שעות בסביבות 150 סל"ד.
8. העבירו 1 מ"ל של תרבית הלילה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וצנטריפוגה את תרבית הלילה ב 6,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
9. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
10. באמצעות מערבולת, להשהות מחדש את הגלולה במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS) 1 מ"ל.
11. צנטריפוגה ב 6,000 × גרם למשך 10 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
12. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-BHI סטרילי מדולל פי עשרה באמצעות מערבולת לצפיפות אופטית של כ-0.1 ב-600 ננומטר.
    הערה: הצפיפות האופטית של כ-0.1 שקולה לכ-10⁷ CFU/מ"ל.

2. כימות ביופילם באמצעות סגול קריסטלי

1. הוסף 200 μL inoculum לכל באר של צלחת פוליסטירן סטרילית 96 בארות (ראה טבלת חומרים) והוסף 200 μL מים deionized לכל אחת הבארות החיצוניות ביותר כדי למנוע את הבארות הפנימיות להתייבש¹⁵.
2. הוסף 200 μL BHI מדולל פי עשרה לכל באר של אותה צלחת כמו בקרה שלילית.
3. לדגור את הצלחת ב 25 ° C במשך 24 שעות.
4. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
   הערה: פיפטה רב-ערוצית היא לעתים קרובות נוחה יותר עבור דגימות מרובות.
5. בזהירות להוסיף 300 μL PBS לכל באר ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
   הערה: פיפטה רב-ערוצית היא לעתים קרובות נוחה יותר עבור דגימות מרובות.
6. חזור על שלב 2.5 פעמיים נוספות.
7. הוסיפו 200 μL תמיסה סגולה קריסטלית (1%) (ראו טבלת חומרים) לכל באר ודגרו ב-RT במשך 30 דקות.
8. חזור על שלבים 2.4-2.6.
9. מוסיפים 200 μL של אתנול מוחלט לכל באר ודגרים במשך 15 דקות ב-RT. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה מספר פעמים.
10. מעבירים 100 μL elution מכל באר לצלחת חדשה של 96 בארות.
11. מדוד את הספיגה ב- 595 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות (ראה טבלת חומרים).
12. כאשר הספיגה עולה על 2.0, בצע דילול תקין של הדגימה לספיגה מתחת ל-2.0 באתנול מוחלט ומדוד אותה כמו בשלב 2.11. לאחר מכן, חשב את ספיגת המדגם (הערך הסופי) על ידי הכפלת הערך הנצפה בגורם הדילול.
13. חישוב הספיגה האמיתית של הדגימות על ידי הפחתת הערך הממוצע של הבקרה השלילית מהערך של כל באר של דגימות הבדיקה על אותה צלחת באר.

3. ספירת כדאיות ביופילם

1. מוסיפים 1 מ"ל אינוקולום (שלב 1) לכל באר של צלחת פוליסטירן סטרילית 12 בארות¹⁵. לדגור את הצלחת ב 25 ° C במשך 24 שעות. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
2. בזהירות להוסיף 1.5 מ"ל PBS סטרילי לכל באר ולהסיר את supernatant עם פיפטה. הוסף 1 מ"ל PBS סטרילי לכל באר.
3. יש לגרד את משטחי הקיר התחתונים והקירות של הבאר באמצעות מגרדי תאים מותאמים.
4. העבירו את תרחיף התאים שנקטף לצינור פלסטיק סטרילי (^10-1) המכיל 9 מ"ל מלוחים (0.85% NaCl) ו-10-20 חרוזי זכוכית (ראו טבלת חומרים).
   הערה: כדי לאסוף שאריות פסולת ביופילם שנותרו על פני השטח התחתונים של הבאר, ניתן להשהות אותה מחדש ולהעביר אותה באמצעות פיפטה באמצעות מי מלח מצינור ^10-1 .
5. מערבל את הצינור ^10-1 במשך 60 שניות במהירות מקסימלית.
6. בצע דילול סדרתי פי 10 על ידי העברת 1 מ"ל לצינור הסטרילי הבא (10-2) המכיל 9 מ"ל מלח (0.85% NaCl) עד ^10-7.
7. מורחים 100 μL מכל דילול על אגר Acinetobacter (ראה טבלת חומרים) ודגרים על צלחות האגר בטמפרטורה של 30°C למשך 24-42 שעות.
8. ספור את מספר המושבות האדומות הטיפוסיות על כל לוח באופן ידני בטווח שבין 10 ל- 250.
9. חשב את מספר התאים בני קיימא בביופילם של כל באר באמצעות המשוואה הבאה:
   תאים בני קיימא = מספר מושבות × גורמי דילול × 10

4. הדמיית ביופילם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)

1. הוסף 200 μL inoculum לכל באר של צלחת סטרילית 96 בארות המיועדת לניתוח מיקרוסקופי.
2. לדגור את הצלחת ב 25 ° C במשך 24 שעות.
3. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
4. מוסיפים בזהירות 300 μL מים מעוקרים בסינון לכל באר ומסירים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
5. חזור על שלב 4.4.
6. הכינו את התערובת של SYTO 9 ופרופידיום יודיד (ראו טבלת חומרים) מדוללים במים מעוקרים בסינון לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו-60 מיקרומטר, בהתאמה.
7. מוסיפים את התערובת לכל באר ב 200 μL ודגרים על הצלחת במשך 20-30 דקות ב RT בחושך.
8. חזור על שלבים 4.3-4.4
9. דמיינו את הביופילמים המחוברים לפני השטח התחתונים באמצעות CLSM עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ו-561 ננומטר וטווח אורכי גל הפליטה של 499-535 ננומטר ו-568-712 ננומטר, בהתאמה.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, הביופילמים של Acinetobacter isolates, שבודדו במקור ממשטחי מטבח, נוצרו על צלחת פוליסטירן בעלת 96 בארות, מוכתמת בסגול קריסטל, והצבעים היו מסיסים באתנול ונמדדו למסת ביופילם (איור 1). מספר הביופילמים השתנה מאוד בהתאם לזנים שנעו בין OD 0.04 ל-1.69 (איור 1). בה...

Discussion

באמצעות הפרוטוקול המתואר, היווצרות הביופילם של מבודדי Acinetobacter בדרגות שונות נמדדה, הודגמה, והוערכו התאים הקיימים בביופילמים (איור 1, איור 2 ואיור 3).

בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות צלזיוס לגידול ו-25 מע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM