تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون لنشاط الدماغ الأمامي في تصرف الزرد البالغ

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في الدماغ الأمامي الظهري لسمك الزرد البالغ.

Abstract

يظهر الزرد البالغ (Danio rerio) ذخيرة غنية من السلوكيات لدراسة الوظائف المعرفية. لديهم أيضا دماغ مصغر يمكن استخدامه لقياس الأنشطة عبر مناطق الدماغ من خلال طرق التصوير البصري. ومع ذلك ، كانت التقارير حول تسجيل نشاط الدماغ في سلوك الزرد البالغ نادرة. تصف الدراسة الحالية إجراءات إجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في الدماغ الأمامي الظهري لسمك الزرد البالغ. نحن نركز على خطوات لمنع أسماك الزرد البالغة من تحريك رؤوسها ، مما يوفر الاستقرار الذي يتيح التصوير بالليزر لنشاط الدماغ. يمكن للحيوانات المقيدة الرأس تحريك أجزاء أجسامها بحرية والتنفس دون مساعدات. يهدف الإجراء إلى تقصير وقت جراحة تقييد الرأس ، وتقليل حركة الدماغ ، وزيادة عدد الخلايا العصبية المسجلة. يتم أيضا وصف الإعداد لتقديم بيئة بصرية غامرة أثناء تصوير الكالسيوم هنا ، والذي يمكن استخدامه لدراسة الارتباطات العصبية الكامنة وراء السلوكيات المحفزة بصريا.

Introduction

كان التصوير الفلوري للكالسيوم باستخدام مؤشرات مشفرة وراثيا أو أصباغ اصطناعية طريقة قوية لقياس النشاط العصبي في الحيوانات التي تتصرف ، بما في ذلك الرئيسيات غير البشرية والقوارض والطيور والحشرات¹. يمكن قياس نشاط مئات الخلايا ، حتى حوالي 800 ميكرومتر تحت سطح الدماغ ، في وقت واحد باستخدام التصوير متعدد الفوتون ^2,3. يمكن أيضا قياس نشاط أنواع معينة من الخلايا عن طريق التعبير عن مؤشرات الكالسيوم في مجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا. يفتح تطبيق طريقة التصوير لنماذج الفقاريات الصغيرة إمكانيات جديدة في مجال حساب الخلايا العصبية عبر مناطق الدماغ.

الزرد هو نظام نموذ....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في Academia Sinica. يمكن العثور على تفاصيل أدوات البحث في جدول المواد.

1. إعداد غرفة التسجيل

1. قم بإعداد خزان شبه سداسي ، ولوحة قاعدة ، ومرحلة رأس (الشكل 1 أ ؛ الملفات التكميلية 1-3). تتكون مرحلة الرأس من عمودين معدنيين متصلين بلوحة دائرية. تحتوي اللوحة الدائرية على أخاديد يمكن قفلها على لوحة القاعدة. بعد قفلها معا ، يتم وضع مرحلة الرأس ولوحة القاعدة في الجزء السفلي من الخزان شبه السداسي.
2. ضع الخزان شبه السداسي على المنصة التجريبية ل....

النتائج

يتكون البروتوكول من جزأين: جراحة تقييد الرأس وتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون للأنشطة العصبية في الدماغ الأمامي. يتم تعريف نجاح الجراحة من خلال بقاء الحيوان واستقرار مسند الرأس. يمكن تحسين معدل البقاء على قيد الحياة بشكل كبير عن طريق التروية المتكررة لمحلول TMS بنسبة 0.01٪ عن طريق الفم أثناء ا.......

Discussion

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتقييد رأس الزرد البالغ لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون. هناك خطوتان حاسمتان لتحقيق مسند رأس مستقر بدرجة كافية للتصوير بالمسح الضوئي بالليزر. أولا ، يجب لصق شريط الرأس على مواقع التعلق المحددة للجماجم. غالبا ما تكون الأجزاء الأخرى من الجمجمة رقيقة جدا بحيث لا توف?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue