הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

Abstract

דגי זברה בוגרים (Danio rerio) מפגינים רפרטואר עשיר של התנהגויות לחקר תפקודים קוגניטיביים. יש להם גם מוח מיניאטורי שיכול לשמש למדידת פעילויות בין אזורי מוח באמצעות שיטות הדמיה אופטית. עם זאת, דיווחים על רישום פעילות מוחית בדגי זברה בוגרים היו נדירים. המחקר הנוכחי מתאר הליכים לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים. אנו מתמקדים בצעדים לריסון דגי זברה בוגרים מלהזיז את ראשם, מה שמספק יציבות המאפשרת הדמיה בלייזר של פעילות המוח. בעלי החיים המרוסנים לראש יכולים להזיז בחופשיות את חלקי גופם ולנשום ללא עזרים. מטרת ההליך היא לקצר את זמן ניתוח ריסון הראש, למזער את תנועת המוח ולמקסם את מספר תאי העצב שנרשמו. כאן מתוארת גם הגדרה להצגת סביבה חזותית אימרסיבית במהלך הדמיית סידן, שניתן להשתמש בה כדי לחקור קורלציות עצביות העומדות בבסיס התנהגויות המופעלות על ידי ראייה.

Introduction

הדמיית סידן פלואורסצנטי עם אינדיקטורים מקודדים גנטית או צבעים סינתטיים הייתה שיטה רבת עוצמה למדידת פעילות עצבית בבעלי חיים מתנהגים, כולל פרימטים לא אנושיים, מכרסמים, ציפורים וחרקים¹. את פעילותם של מאות תאים, עד כ-800 מיקרומטר מתחת לפני השטח של המוח, ניתן למדוד בו זמנית באמצעות דימות רב-פוטוני ^2,3. ניתן למדוד את פעילותם של סוגי תאים מסוימים גם על ידי ביטוי מדדי סידן באוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטית. יישום שיטת ההדמיה עבור מודלים קטנים של בעלי חוליות פותח אפשרויות חדשות בתחום החישוב העצבי על פני אזורי מוח.

דגי זברה הם מערכת מודל נפוצה במחקר מדעי המוח. דגי זברה....

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה סיניקה. פירוט כלי המחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. הכנת תא הקלטה

1. הכינו מכל חצי משושה, פלטת בסיס ובמת ראש (איור 1A; קבצים משלימים 1-3). שלב הראש מורכב משני עמודי מתכת המחוברים ללוח עגול. הצלחת העגולה מכילה חריצים שניתן לנעול על לוח הבסיס. לאחר שננעלו יחד, שלב הראש וצלחת הבסיס מונחים בתחתית המיכל המשושה למחצה.
2. מניחים את המיכל המשושה למחצה על פלטפורמת הניסוי של המיקרוסקופ. הפלטפורמה אמורה להיות מסוגלת לנוע בכיווני X ו- Y מבלי לפגוע במגבלה של של....

תוצאות

הפרוטוקול מורכב משני חלקים: ניתוח ריסון ראש והדמיית סידן בשני פוטונים של פעילות עצבית במוח הקדמי. הצלחת הניתוח מוגדרת על ידי הישרדות החיה ויציבות ריסון הראש. ניתן לשפר מאוד את שיעור ההישרדות על ידי זילוח תכוף של תמיסת TMS 0.01% דרך הפה במהלך הניתוח. דגים צריכים להתאושש מהרדמה ולנשום באופן פעיל.......

Discussion

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לריסון ראשם של דגי זברה בוגרים לצורך הדמיית סידן של שני פוטונים. ישנם שני שלבים קריטיים להשגת משענת ראש יציבה מספיק להדמיית סריקת לייזר. ראשית, מוט הראש צריך להיות מודבק לאתרי החיבור הספציפיים של הגולגולות. חלקים אחרים של הגולגולת הם לעתים קרובות דקים מכ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue