Davranan Yetişkin Zebra Balıklarında Ön Beyin Aktivitesinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi

Özet

Burada, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Yetişkin zebra balığı (Danio rerio) bilişsel işlevleri incelemek için zengin bir davranış repertuarı sergiler. Ayrıca, optik görüntüleme yöntemleriyle beyin bölgelerindeki aktiviteleri ölçmek için kullanılabilecek minyatür bir beyne sahiptirler. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında beyin aktivitesinin kaydedilmesine ilişkin raporlar azdır. Bu çalışma, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme gerçekleştirme prosedürlerini açıklamaktadır. Yetişkin zebra balıklarının başlarını hareket ettirmesini engellemeye yönelik adımlara odaklanıyoruz, bu da beyin aktivitesinin lazerle taranarak görüntülenmesini sağlayan stabilite sağlıyor. Kafası kısıtlanmış hayvanlar, vücut kısımlarını serbestçe hareket ettirebilir ve yardım almadan nefes alabilir. Prosedür, baş desteği ameliyatının süresini kısaltmayı, beyin hareketini en aza indirmeyi ve kaydedilen nöron sayısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Kalsiyum görüntüleme sırasında sürükleyici bir görsel ortam sunmak için bir kurulum da burada açıklanmıştır ve bu, görsel olarak tetiklenen davranışların altında yatan nöral bağıntıları incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Genetik olarak kodlanmış göstergeler veya sentetik boyalarla kalsiyum floresan görüntüleme, insan olmayan primatlar, kemirgenler, kuşlar ve böcekler dahil olmak üzere davranan hayvanlarda nöronal aktiviteyi ölçmek için güçlü bir yöntem olmuştur¹. Beyin yüzeyinin yaklaşık 800 μm altına kadar yüzlerce hücrenin aktivitesi, çoklu foton görüntüleme ^2,3 kullanılarak aynı anda ölçülebilir. Spesifik hücre tiplerinin aktivitesi, genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonlarda kalsiyum göstergelerinin eksprese edilmesiyle de ölçülebilir. Küçük omurgalı modelleri için görüntüleme yönteminin uygulanması, beyin bölgeleri arasında nöronal hesaplama alanında yeni olanaklar sunmaktadır.

Zebra balığı, sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir model sistemdir. Döllenmeden yaklaşık 6 gün sonra larva zebra balıkları, minyatür beyinleri ve şeffaf gövdeleri nedeniyle kalsiyum görüntüleme için kullanılmıştır⁴. Yavru zebra balığı (3-4 haftalık) ayrıca sensorimotor yolların altında yatan nöral mekanizmaları incelemek için kullanılır ^5,6. Bununla birlikte, ilişkisel öğrenme ve sosyal davranışlar da dahil olmak üzere karmaşık davranışlar için maksimum performans düzeyine^daha büyük yaşta ulaşılır ^7,8. Bu nedenle, görüntüleme yöntemlerini kullanarak yetişkin zebra balıklarının beyinlerindeki çoklu bilişsel işlevleri incelemek için güvenilir bir protokol gereklidir. Zebra balığı larvaları ve yavru zebra balıkları in vivo görüntüleme için agaroza gömülebilirken, 2 aylık veya daha büyük yetişkin zebra balıkları bu tür koşullarda hipoksiden muzdariptir ve fiziksel olarak agaroz tarafından sınırlandırılamayacak kadar güçlüdür. Bu nedenle, beyni stabilize etmek ve hayvanın solungaçlardan serbestçe nefes almasını sağlamak için cerrahi bir prosedür gereklidir.

Burada, tek bir baş çubuğunun yeni bir tasarımını içeren bir koltuk başlığı protokolünü açıklıyoruz. 25 dakikalık kısaltılmış ameliyat süresi, önceki yönteme göre iki kat daha hızlıdır⁹. Ayrıca kayıt odasının (yarı altıgen tank), kafa aşamasının ve iki parçayı birleştirmek için hızlı kilitleme mekanizmasının tasarımını da açıklıyoruz⁹. Son olarak, görsel olarak tetiklenen beyin aktivitesini ve davranışlarını incelemek için sürükleyici bir görsel uyaran sunma kurulumu da açıklanmaktadır. Genel olarak, burada açıklanan prosedürler, kafası kısıtlanmış yetişkin bir zebra balığında genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarında iki fotonlu kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir ve çeşitli davranışsal paradigmalar sırasında beyin aktivitelerinin araştırılmasını sağlar.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Academia Sinica Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Araştırma araçlarının ayrıntıları Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Kayıt odasının hazırlanması

1. Yarı altıgen bir tank, bir taban plakası ve bir kafa aşaması hazırlayın (Şekil 1A; Ek Dosyalar 1-3). Baş aşaması, dairesel bir plakaya tutturulmuş iki metal direkten oluşur. Dairesel plaka, taban plakasına kilitlenebilen oluklar içerir. Birbirine kilitlendikten sonra, kafa aşaması ve taban plakası yarı altıgen tankın altına yerleştirilir.
2. Yarı altıgen tankı mikroskobun deney platformuna yerleştirin. Platform, çeviri aşamasının sınırına çarpmadan X ve Y yönlerinde hareket edebilmelidir.
3. Davranışsal kayıt için 810 nm kızılötesi (IR) ışığı ve kamerayı baş sahneye doğrultun. Kameranın görüş alanının yetişkin bir zebra balığının sığabileceği kadar geniş olduğundan emin olun.
   1. İki fotonlu lazerin ve görsel uyaranın davranışsal kayda müdahale etmesini önlemek için, kameranın önüne sırasıyla 875 nm kısa geçiren filtre ve 700 nm uzun geçiren filtre kurun.
4. Görsel uyaranı sunmak için, yarı altıgen tankın üç duvarının iç tarafına geri projeksiyon filmleri takın (Şekil 1A).
5. Üç projektörü tankın üç yüzeyine doğrultun. Üç görüntü, sürekli bir görsel sahne oluşturacak şekilde hizalanmalıdır. Projektör ışıklarının kalsiyum floresan sinyalini kirletmesini önlemek için, her projektörün önüne bir nötr yoğunluk filtresi ve bir kırmızı renk filtresi (600 nm, uzun geçişli) yerleştirin ve fotoçoğaltıcı tüpün (PMT) önüne bir bant geçiren filtre (510/80 nm) yerleştirin.

Şekil 1: Baş desteği ameliyatı için gerekli aletler. (A) Baş aşamasının dairesel plakası ile yarı altıgen tankın içindeki taban plakası arasındaki hızlı kilitleme mekanizması. Özel yapım parçaların bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyaları Ek Dosyalar 1-4'te bulunabilir. (B) Baş desteği için Ω şeklinde kafa çubuğu. (C) Kafa çubuğunu bağlantı yerine konumlandırmak için kullanılan üç eksenli mikro manipülatör. İç: kafa çubuğunun kil içindeki yönü. (D) Ameliyat sırasında balığı tutmak için top. Ek: topun içindeki balıkların oryantasyonu. (E) Balık yükleme modülü ve balığı baş aşamasına yüklemek için kullanılan mikromanipülatör. Ek: modül içindeki balıkların oryantasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Baş desteği ameliyatı

1. Ω şeklinde bir kafa çubuğu hazırlayın (Şekil 1B; Ek Dosya 4) zebra balığı baş desteği için. Bunu yapmak için, üç eksenli bir mikromanipülatöre bir parça yağ bazlı modelleme kili takın. Kilin baş çubuğunu tutacak kadar sağlam, ancak baş desteğinden sonra baş çubuğundan ayrılacak kadar yumuşak olduğundan emin olun.
2. Kafa çubuğunun bir kolunu kile sokun ve kafa çubuğunu yatay olarak yönlendirin (Şekil 1C). Bu, baş çubuğunun zebra balığına daha sonra bağlanmasının düz olmasını sağlayacaktır.
   NOT: Kafa çubuğu titanyumdan (24 mg) veya paslanmaz çelikten (43 mg) yapılabilir ve birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Baş çubuğu malzemesi, yetişkin zebra balıklarının (ağırlık 300-1.000 mg arasında değişir) baş desteği altındaki davranışını etkilemez.
3. Ameliyat sırasında balık gövdesini yerinde tutmak için içi boş bir tüp olan topu hazırlayın (Şekil 1D).
4. Akvaryum suyunda %0.03 ve %0.01 trikain metansülfonat (TMS; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Bu, ameliyat sırasında balığı uyuşturmak ve yatıştırılmış bir durumda tutmak için kullanılacaktır.
5. Kafatasındaki bağlantı yerlerinden fazla deri ve suyu çıkarmak için dört doku çubuğu hazırlayın. Her bir çubuğu hazırlamak için, bir kağıt havluyu 3 cm'lik bir kareye kesin ve tüp benzeri bir yapı oluşturmak için köşegeni boyunca katlayın. Tüpün uçlarını ince bir noktaya bükün. Bağlantı yeri çok küçüktür, bu nedenle ince bir nokta, swabın daha hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar.
6. Mikromanipülatör için bir balık yükleme modülü hazırlayın (Şekil 1E).
   NOT: Modül, dik açılı bir direk kelepçesi ile bir arada tutulan iki çelik direkten oluşur. Bir direk mikromanipülatöre takılırken, diğer direk balığı taşıyan dönen bir direk kelepçesi tutar. Modül, balığı hassas bir kontrolle baş aşamasına yerleştirmek için kullanılır. Dönen direk kelepçesi, balığın eğim açısını değiştirmek için bir adım ayarlayıcı görevi görür.
7. Akvaryum suyunda% 0.03 TMS ile balıkları uyuşturun. Aşağıdaki adımlar boyunca, akvaryum suyunda% 0.01 TMS'yi her 90 saniyede bir kısa darbelerle ağza vermek için bir şırınga kullanın. Perfüzyondan gelen su akışı solungaç hareketini indüklemelidir. Bu, balığın ameliyat sırasında 40 dakikadan fazla hayatta kalmasını sağlayacaktır.
   NOT: Tg [neuroD: GCaMP6f], hem larva hem de yetişkin aşamalarında ön beyindeki kalsiyum göstergesinin geniş ekspresyonu nedeniyle kullanılır¹⁰.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, ameliyatta her iki elin meşgul olduğu dönemlerde ağza sürekli su akışı sağlamak için yerçekimi perfüzyonu kullanın.
8. Balıkları, balığı topun içinde tutan bir kapsüle (Şekil 2A) sarın.
   1. Anestezi uygulanmış balığı kuyruğun ucundan başlayarak solungaçtan solungaca yaklaşık 1 mm kaudal olacak şekilde bir parça nemli kağıt mendile sarın. Balığın dokudan kaymasını önlemek için sargının sıkı olduğundan emin olun.
   2. Balığı kuyruğun ucundan solungaçtan yaklaşık 2 mm kaudal'a kadar örtmek için kağıt mendilin etrafına uzunlamasına yarıklı (örneğin, orta büyüklükte ısıyla daralan bir boru) yumuşak bir plastik boru sarın. Boru, balığın vücudunun ameliyat boyunca düz kalmasını sağlar.
   3. Borunun etrafına kabaca topun çapına benzer bir çapa kadar bir kağıt havlu sarın.
   4. Plastik transfer pipetinin ampulünden kesilmiş yumuşak bir plastik tüpü kağıt havlunun etrafına sarın. Bu, kapsülün topa sorunsuz bir şekilde yüklenebilmesini sağlar.
   5. Balıkları topun içine yükleyin.
9. Bağlanma yerlerini kaplayan deriyi, kafatasının beyincik rostrolateralinde ve solungaçların üzerinde iki üçgen bölgesini çıkarmak için bir neşter kullanın (Şekil 2B), ardından bağlanma bölgeleri arasındaki bölgeyi kaplayan cildi çıkarın. Bağlanma bölgelerini kurutmak ve kalan cildi temizlemek için doku çubukları kullanın.
   1. Derinin çıkarılması sırasında başı desteklemek için ayarlanabilir bir platform kullanın, ancak operasyon sırasında göz yaralanmasını önlemek için platform gözlere temas etmemelidir.
      NOT: Bağlanma bölgelerindeki derinin tamamen çıkarılması, görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltmada çok önemlidir.
10. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak her bağlantı bölgesinin ortasına bir damla doku yapıştırıcısı (Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın.
    NOT: Doku yapıştırıcısı bağlantı yerlerini kaplar ve çabuk kurur. Doku yapıştırıcısı, kafatası ile kafa çubuğunu yapıştırmak için kullanılan diş çimentosu arasında bir bağlanma arayüzü sağlar ve solungaçlardan gelen suyun bağlantı bölgesine ulaşmasını önler.
11. Balık gövdesini dik konuma getirin ve baş çubuğu yapıştırmaya hazırlanırken baş çubuğunu biraz yukarıya ve bağlantı yerlerine kaudal olarak yerleştirin.
12. Diş çimentosu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve kafa çubuğunu kafatasına yapıştırmak için hemen kullanın (Şekil 2C). İşlem zamana duyarlıdır ve 45 saniye içinde yapılmalıdır.
    1. Küçük bir kaşık polimeri dört damla hızlı monomer ve bir damla katalizör V ile karıştırın. Karışımı 15 saniye boyunca eşit şekilde karıştırın.
    2. Karışımı bağlantı bölgelerine ve bölgeler arasındaki bölgeye uygulamak için bir mikropipet ve 10 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Solungaçları ve gözleri kapatmaktan kaçının.
    3. Mikromanipülatörü kullanarak baş çubuğunu çimentoya hafifçe bastırın. Baş çubuğunu kalan çimento ile örtün.
    4. Diş çimentosunun kürlenmesi için 12 dakika bekleyin. Çimento ile su temasından kaçının.
13. Kalsiyum görüntüleme için ön beyne optik erişimi iyileştirmek için, telensefalonun üzerindeki cildi çıkarın. Derinin çıkarılması, bir neşter kullanılarak beş kesi ile 3 dakika içinde yapılabilir (Şekil 2D). Kafataslarının yüzeyine yapışan lipit damlacıklarının çıkarıldığından emin olun.
14. Sertleştikten sonra kili baş çubuğundan çıkarın.
15. Tüm kapsülü toptan mikromanipülatörün balık yükleme modülündeki zift ayarlayıcıya aktarın.
16. Balığı konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın. Baş çubuğu, baş aşamasının metal direklerinin üzerine yerleştirilmelidir. İki fotonlu görüntüleme sırasında ön beynin yüzeyinin optik düzleme daha iyi hizalanabilmesi için balığın eğim açısını hafifçe artırın.
17. Kafa çubuğunu ultraviyole (UV) ile kürlenebilen yapıştırıcı ile metal direklere yapıştırın. Kürlenme için 15 sn UV'ye maruz kalma yeterlidir.
18. Balığı kapsülden dışarı çekin ve baş aşamasını yarı altıgen tankın içindeki taban plakasına kilitleyin.
19. Hayvanı akvaryum suyuna daldırın. Balık 1-2 dakika içinde nefes almaya başlamalı ve anesteziden kurtulmalıdır.
    NOT: İsteğe bağlı olarak, ağza tatlı su vermek için şırınga perfüzyonu kullanın.

Şekil 2: Baş desteği ameliyatı sırasındaki önemli adımlar . (A) Topun içindeki kapsülün bileşimi. (B) Kafatasındaki bağlanma yerleri (kırmızı). Kırmızı oklar kan damarı bölgelerini belirtir. (C) Üst: balık kafatasına bağlı baş çubuğu. Altta: baş sahneye yüklenen balık. (D) Ön beynin üzerindeki deriyi çıkarmak için gerekli kesikler. Sayılar kesme sırasını gösterir. Hayvanın kanamasını önlemek için işaretli bölgede (ok ucu) derinin çıkarılmasından kaçının. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. İki fotonlu görüntüleme

1. Lazeri açın ve gücün dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Örnekte dalga boyunu 920 nm'ye ve gücü yaklaşık 50 mW'a ayarlayın.
   NOT: Rezonans tarayıcı tarafından kontrol edilen lazer ışını, tarama yolunun geri dönüş noktalarında yavaşça hareket eder. Doku hasarını önlemek için, geri dönüş noktalarında lazer gücünü azaltmak için bir Pockels hücresi kullanılır.
2. Kafası sabitlenmiş zebra balığını içeren kayıt odasını deney platformuna yerleştirin (Şekil 3A). Platform, çeviri aşamasının sınırına çarpmadan X ve Y yönlerinde hareket edebilmelidir.
3. Objektif lensi ön beyin yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Objektif mercek, göz bebeğinin ön kenarına yönelik olmalıdır (Şekil 3B).
4. Lazer deklanşörünü açın ve PMT'yi etkinleştirin. Floresan görüntüsünde dorsal ön beyin ortaya çıkana kadar objektif lensi (~1 mm) kademeli olarak yükseltin (Şekil 3C).
5. Kaydedilen nöron sayısını artırmak için, birden fazla derinlikte (15 μm aralıklarla altı görüntü düzlemi) görüntü elde etmek için bir piezo aktüatör kullanın. Bu, kare hızı pahasına veri verimini artıracaktır. Piezo aktüatörü kontrol etmek için hızlı Z ekseni taramasını etkinleştirin (tek tip mod, dilim sayısı = 6, adım boyutu = 15 μm, dalga formu = testere dişi, geri dönüş süresi = 4 ms, aktüatör gecikmesi = 8 ms).
6. Davranış kaydı için, tankın her iki tarafındaki 810 nm kızılötesi (IR) ışıkları açın. Kamerada net bir şekilde görülebilmesi gereken tüm gövdeyi aydınlatmak için açıyı ayarlayın.
7. Projektörleri açın.
8. Verileri kaydetmeye başlayın.

Şekil 3: Kalsiyum görüntüleme, davranış kaydı ve görsel uyaran gösterimi gerçekleştirmek için kurulum . (A) Üç projektör, yarı altıgen tankın duvarlarına görsel bir uyaran sunar. Zebra balığının vücudunu aydınlatmak için yan taraftaki IR ışıkları kullanılır. (B) Objektif merceğin konumlandırılması. Sol: önden görünüm. Sağ: yandan görünüm. 16x objektif mercek ile hedeflenen beyin bölgesi arasındaki mesafe yaklaşık 2,5 mm'dir. (C) Örnek iki fotonlu görüntü. Solda: Tg[neuroD:GCaMP6f] cinsinden tüm dorsal ön beynin maksimum projeksiyonu. Sağda: birden fazla beyin bölgesindeki nöronları ortaya çıkarmak için yakınlaştırılmış görüntü. İçindekiler: farklı bir beyin bölgesinden daha yüksek bir büyütme. Görüntüler, 5 Hz'de kaydedilen 10 saniyelik verinin ortalamasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Protokol iki bölümden oluşur: baş desteği cerrahisi ve ön beyindeki nöronal aktivitelerin iki fotonlu kalsiyum görüntülemesi. Ameliyatın başarısı, hayvanın hayatta kalması ve baş desteğinin stabilitesi ile tanımlanır. Hayatta kalma oranı, ameliyat sırasında ağızdan% 0.01 TMS çözeltisinin sık sık perfüzyonu ile büyük ölçüde iyileştirilebilir. Balıklar anesteziden kurtulmalı ve akvaryum suyuna daldırıldıktan sonra 1-2 dakika içinde aktif olarak nefes almalıdır. İki fotonlu kalsi...

Tartışmalar

Burada, iki fotonlu kalsiyum görüntüleme için yetişkin zebra balığının kafasını dizginlemek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Lazer tarama görüntüleme için yeterince stabil bir koltuk başlığı elde etmek için iki kritik adım vardır. İlk olarak, kafa çubuğu kafataslarının belirli bağlantı yerlerine yapıştırılmalıdır. Kafatasının diğer kısımları genellikle mekanik stabilite sağlamak için çok incedir ve hatta güçlü vücut hareketleri sırasında kırılabilir. İki...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue