Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung der Vorderhirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.

Zusammenfassung

Ausgewachsene Zebrafische (Danio rerio) weisen ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen zur Untersuchung kognitiver Funktionen auf. Sie verfügen auch über ein Miniaturgehirn, mit dem Aktivitäten in verschiedenen Hirnregionen durch optische Bildgebungsverfahren gemessen werden können. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Aufzeichnung der Gehirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen. Die vorliegende Studie beschreibt Verfahren zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von adulten Zebrafischen. Wir konzentrieren uns auf Schritte, um erwachsene Zebrafische daran zu hindern, ihren Kopf zu bewegen, was eine Stabilität bietet, die eine Laserscanning-Bildgebung der Gehirnaktivität ermöglicht. Die kopfgefesselten Tiere können ihre Körperteile frei bewegen und ohne Hilfsmittel atmen. Das Verfahren zielt darauf ab, die Zeit der Kopfstützenoperation zu verkürzen, die Gehirnbewegung zu minimieren und die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu maximieren. Hier wird auch ein Aufbau zur Darstellung einer immersiven visuellen Umgebung während der Kalziumbildgebung beschrieben, der verwendet werden kann, um neuronale Korrelate zu untersuchen, die visuell ausgelösten Verhaltensweisen zugrunde liegen.

Einleitung

Die Kalziumfluoreszenz-Bildgebung mit genetisch kodierten Indikatoren oder synthetischen Farbstoffen ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der neuronalen Aktivität bei sich verhaltenden Tieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, Nagetiere, Vögel und Insekten¹. Die Aktivität von Hunderten von Zellen, bis zu etwa 800 μm unter der Gehirnoberfläche, kann gleichzeitig mit Hilfe der Multi-Photonen-Bildgebung gemessen^{werden 2,3}. Die Aktivität bestimmter Zelltypen kann auch durch die Expression von Kalziumindikatoren in genetisch definierten neuronalen Populationen gemessen werde....

Protokoll

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Academia Sinica genehmigt und durchgeführt. Details zu den Forschungsinstrumenten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung der Aufnahmekammer

1. Bereiten Sie einen halbsechseckigen Tank, eine Grundplatte und eine Kopfstufe vor (Abbildung 1A; Ergänzungsakten 1-3). Die Kopfstufe besteht aus zwei Metallpfosten, die an einer kreisförmigen Platte befestigt sind. Die runde Platte enthält Nuten, die auf der Grundplatte arretiert werd....

Diskussion

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Fixierung des Kopfes von erwachsenen Zebrafischen für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung. Es gibt zwei entscheidende Schritte, um eine Kopfstütze zu erreichen, die stabil genug für die Laserscanning-Bildgebung ist. Zuerst muss der Kopfbügel auf die spezifischen Befestigungsstellen der Schädel geklebt werden. Andere Teile des Schädels sind oft zu dünn, um mechanische Stabilität zu gewährleisten, und können bei starken Körperbewegungen sogar gebrochen werden.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue