成年斑马鱼前脑活动的双光子钙成像

摘要

在这里，我们提出了一种在成年斑马鱼的背前脑中进行双光子钙成像的方案。

摘要

成年斑马鱼（Danio rerio）表现出丰富的行为，用于研究认知功能。它们还有一个微型大脑，可用于通过光学成像方法测量跨大脑区域的活动。然而，关于记录成年斑马鱼大脑活动的报道很少。本研究描述了在成年斑马鱼背侧前脑进行双光子钙成像的程序。我们专注于限制成年斑马鱼移动头部的步骤，这提供了稳定性，可以对大脑活动进行激光扫描成像。头部束缚的动物可以在没有辅助工具的情况下自由移动身体部位和呼吸。该手术旨在缩短头部约束手术的时间，最大限度地减少大脑运动，并最大限度地增加记录的神经元数量。本文还描述了在钙成像过程中呈现沉浸式视觉环境的设置，可用于研究潜在的视觉触发行为的神经相关性。

引言

使用基因编码指示剂或合成染料的钙荧光成像一直是测量行为动物（包括非人灵长类动物、啮齿动物、鸟类和昆虫）神经元活动的有效方法¹。使用多光^{子成像可以}同时测量数百个细胞的活动，这些细胞在脑表面以下约800μm处^2,3。特定细胞类型的活性也可以通过在遗传定义的神经元群中表达钙指示剂来测量。成像方法在小型脊椎动物模型中的应用为跨大脑区域的神经元计算领域开辟了新的可能性。

斑马鱼是神经科学研究中广泛使用的模型系统。受精后 6 天左右的斑马鱼幼虫由于其微型大脑和透明的身体而被用于钙成像⁴.幼年斑马鱼（3-4周龄）也用于研究感觉运动通路的神经机制^5,6。然而，复杂行为（包括联想学习和社会行为）的最大表现水平是在年龄^{较大的 7,8} 岁时达到的。因此，需要一个可靠的方案来使用成像方法研究成年斑马鱼大脑中的多种认知功能。虽然斑马鱼幼虫和幼年斑马鱼可以嵌入琼脂糖中进行活体成像，但 2 个月或以上的成年斑马鱼在这种情况下会缺氧，并且身体太强壮....

研究方案

所有动物程序均按照中央研究院动物护理和使用机构委员会的指导方针批准和执行。研究工具的详细信息可以在 材料表中找到。

1、录音室的准备

1. 准备一个半六角形罐、一个底板和一个头部阶段（图1A;补充文件1-3）。头部平台由连接到圆形板上的两个金属柱组成。圆形板包含可以锁定在底板上的凹槽。锁定在一起后，头级和底板铺设在半六角形罐的底部。
2. 将半六角形槽放在显微镜的实验平台上。平台应该能够在 X 和 Y 方向上移动，而不会达到平移阶段的极限。
3. 将 810 nm 红外 （IR） 光和相机对准头部tage 进行行为记录。确保相机的视野足够大，可以容纳成年斑马鱼。
   1. 为防止双光子激光和视觉刺激干扰行为记录，请在相机前分别设置875nm短通滤光片和700nm长通滤光片。
4. 为了呈现视觉刺激，将背投薄膜贴在半六边形罐的三个壁的内侧（图1A）。
5. 将三个投影仪对准水箱的三个表面。三个图像应对齐以形成一个连续的视觉场景。为防止投影机灯污染钙荧光信号，请在每台投影机前面放置一个中性密度滤光片和一个红色滤光片（600 nm，长通），并在光电倍增管 （PMT） ....

讨论

在这里，我们描述了一种详细的方案，以限制成年斑马鱼的头部进行双光子钙成像。要实现足够稳定的头枕，有两个关键步骤可以进行激光扫描成像。首先，头杆必须粘在头骨的特定附着部位。颅骨的其他部位通常太薄，无法提供机械稳定性，甚至可能在剧烈的身体运动中骨折。其次，必须彻底去除附着部位上方的皮肤。残留的水也应彻底干燥。这使得头骨能够与组织胶紧密结合。提供了一个表?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue