행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

요약

여기에서는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

성인 제브라피시(Danio rerio)는 인지 기능을 연구하기 위한 다양한 행동 레퍼토리를 보여줍니다. 그들은 또한 광학 이미징 방법을 통해 뇌 영역 전체의 활동을 측정하는 데 사용할 수 있는 소형 뇌를 가지고 있습니다. 그러나 성인 제브라피쉬의 뇌 활동 기록에 대한 보고는 드물었다. 본 연구는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 절차를 설명합니다. 우리는 성인 제브라피시가 머리를 움직이지 못하도록 억제하는 단계에 중점을 두며, 이는 뇌 활동의 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 하는 안정성을 제공합니다. 머리에 묶인 동물은 보조 기구 없이 신체 부위를 자유롭게 움직이고 숨을 쉴 수 있습니다. 이 시술은 머리 구속 수술 시간을 단축하고 뇌 운동을 최소화하며 기록되는 뉴런 수를 최대화하는 것을 목표로 합니다. 칼슘 이미징 중에 몰입형 시각적 환경을 제공하기 위한 설정도 여기에 설명되어 있으며, 이는 시각적으로 트리거된 행동의 기본 신경 상관 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

유전적으로 인코딩된 지표 또는 합성 염료를 사용한 칼슘 형광 이미징은 인간이 아닌 영장류, 설치류, 조류 및 곤충을 포함한 행동하는 동물의 신경 활동을 측정하는 강력한 방법이었습니다¹. 뇌 표면 아래 최대 약 800μm까지 수백 개의 세포 활동을 다광자 이미징 ^2,3을 사용하여 동시에 측정할 수 있습니다. 특정 세포 유형의 활성은 유전적으로 정의된 신경 세포 집단에서 칼슘 지표를 발현하여 측정할 수도 있습니다. 작은 척추동물 모델에 이미징 방법을 적용하면 뇌 영역 전반에 걸쳐 신경 계산 분야에서 새로운 가능성이 열립니다.

제브라피시는 신경 과학 연구에서 널리 사용되는 모델 시스템입니다. 수정 후 약 6일이 지난 제브라피시 유충은 작은 뇌와 투명한 몸체로 인해 칼슘 이미징에 사용되어 왔다⁴. 어린 제브라피시(생후 3-4주)는 감각 운동 경로 ^5,6의 기저에 있는 신경 메커니즘을 연구하는 데에도 사용됩니다. 그러나 연상 학습 및 사회적 행동을 포함한 복잡....

프로토콜

모든 동물 시술은 Academia Sinica의 Institutional Animal Care and Use Committee의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 연구 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

1. 기록실의 준비

1. 반 육각형 탱크, 베이스 플레이트 및 헤드 스테이지를 준비합니다(그림 1A; 보충 파일 1-3). 헤드 스테이지는 원형 플레이트에 부착된 두 개의 금속 기둥으로 구성됩니다. 원형 플레이트에는 베이스 플레이트에 잠글 수 있는 홈이 있습니다. 함께 잠긴 후 헤드 스테이지와 베이스 플레이트는 반 육각형 탱크의 바닥에 놓입니다.
2. 반육각형 탱크를 현미경의 실험 플랫폼에 놓습니다. 플랫폼은 변환 단계의 한계에 도달하지 않고 X 및 Y 방향으로 이동할 수 있어야 합니다.
3. 810nm 적외선(IR)과 카메라를 헤드 스테이지로 향하게 하여 동작을 기록합니다. 카메라의 시야가 성인 제브라피쉬가 들어갈 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오.
   1. 이광자 레이저와 시각 자극이 행동 기록을 방해하지 않도록 카메라 앞....

토론

여기에서는 이광자 칼슘 이미징을 위해 성인 제브라피쉬의 머리를 억제하는 자세한 프로토콜을 설명합니다. 레이저 스캐닝 이미징에 충분히 안정적인 머리 지지대를 얻기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 헤드 바를 두개골의 특정 부착 부위에 붙여야 합니다. 두개골의 다른 부분은 종종 너무 얇아서 기계적 안정성을 제공하지 못하며 격렬한 신체 움직임 중에 골절될 수도 있습니다. ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue