Двухфотонная кальциевая визуализация активности переднего мозга у взрослых рыбок данио-рерио

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выполнения двухфотонной визуализации кальция в дорсальном переднем мозге взрослых рыбок данио.

Аннотация

Взрослые рыбки данио (Danio rerio) демонстрируют богатый репертуар поведения для изучения когнитивных функций. У них также есть миниатюрный мозг, который может быть использован для измерения активности в различных областях мозга с помощью методов оптической визуализации. Тем не менее, сообщения о регистрации активности мозга у взрослых рыбок данио-рерио были скудными. В настоящем исследовании описаны процедуры выполнения двухфотонной визуализации кальция в дорсальном переднем мозге взрослых рыбок данио. Мы фокусируемся на шагах, направленных на то, чтобы удержать взрослых рыбок данио от движения головой, что обеспечивает стабильность, позволяющую проводить лазерное сканирование активности мозга. Животные с ограниченной головой могут свободно двигать частями тела и дышать без вспомогательных средств. Процедура направлена на сокращение времени операции по удержанию головы, минимизацию движений мозга и максимальное количество регистрируемых нейронов. Здесь также описана установка для представления иммерсивной визуальной среды во время визуализации кальция, которая может быть использована для изучения нейронных коррелятов, лежащих в основе визуально запускаемого поведения.

Введение

Флуоресцентная визуализация кальция с генетически кодируемыми индикаторами или синтетическими красителями является мощным методом измерения активности нейронов у животных, включая нечеловекообразных приматов, грызунов, птиц и^{насекомых.} Активность сотен клеток, расположенных на глубине примерно до 800 мкм под поверхностью мозга, может быть измерена одновременно с помощью многофотонной визуализации ^2,3. Активность определенных типов клеток также может быть измерена путем экспрессии показателей кальция в генетически определенных популяциях нейронов. Применение метода визуализации для модел....

протокол

Все процедуры для животных были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Academia Sinica. Подробную информацию об инструментах исследования можно найти в Таблице материалов.

1. Подготовка записывающей камеры

1. Подготовьте полушестигранный резервуар, опорную плиту и головную ступень (Рисунок 1А; Дополнительные файлы 1-3). Головная ступень состоит из двух металлических стоек, прикрепленных к круглой пластине. Круглая пластина содержит канавки, которые можно зафиксиро....

Результаты

Протокол состоит из двух частей: операция на подголовнике и двухфотонная кальциевая визуализация активности нейронов в переднем мозге. Успех операции определяется выживаемостью животного и устойчивостью подголовника. Выживаемость может быть значительно улучшена за счет частой перф.......

Обсуждение

Здесь мы опишем подробный протокол для фиксации головы взрослой рыбки данио для двухфотонной кальциевой визуализации. Есть два важных шага для достижения того, чтобы подголовник был достаточно устойчивым для лазерной сканирующей визуализации. Во-первых, планка головы должна быть при?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue