A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتمايز الموجه والتحليل الوظيفي للخلايا الشبيهة بالخلايا β. نحن نصف ظروف وممرات الثقافة المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات قبل توليد خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. يتطور التمايز المكون من ست مراحل من تكوين الأديم الباطن النهائي إلى خلايا وظيفية تشبه الخلايا β تفرز الأنسولين استجابة للجلوكوز.

Abstract

يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى أي نوع من الخلايا ، مما يجعلها مصدرا بديلا ممتازا لخلايا β البنكرياس البشرية. يمكن أن تكون hPSCs إما خلايا جذعية جنينية (hESCs) مشتقة من الكيسة الأريمية أو خلايا مستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) متولدة مباشرة من الخلايا الجسدية باستخدام عملية إعادة البرمجة. هنا يتم تقديم بروتوكول قائم على الفيديو لتحديد الثقافة المثلى وظروف المرور ل hPSCs ، قبل تمايزها وتوليدها لاحقا لخلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. تتبع هذه المنهجية العملية المكونة من ست مراحل للتمايز الموجه للخلايا β ، حيث تتمايز hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وأنبوب الأمعاء البدائي ، ومصير الأمعاء الأمامية الخلفية ، وأسلاف البنكرياس ، وأسلاف الغدد الصماء في البنكرياس ، وفي النهاية خلايا β البنكرياس. من الجدير بالذكر أن منهجية التمايز هذه تستغرق فترة 27 يوما لتوليد خلايا β البنكرياس البشرية. تم تقييم إمكانات إفراز الأنسولين من خلال تجربتين ، والتي تضمنت التلوين المناعي وإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.

Introduction

تتمتع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بقدرة فريدة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مما يجعلها بديلا قابلا للتطبيق لخلايا β البنكرياس البشرية1. يتم تصنيف هذه hPSCs إلى نوعين: الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) ، المشتقة من الكيسة الأريمية2 ، والخلايا المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) ، الناتجة عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية مباشرة3. إن تطوير تقنيات للتمييز بين hPSCs إلى خلايا β ، له آثار مهمة على كل من البحث الأساسي والممارسة السريرية 1,4. داء السكري هو مرض مزمن يصيب > 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وينتج عن عدم قدر....

Protocol

قبل البدء في التمايز ، يوصى بتحديد العدد المطلوب من الكائنات العضوية الشبيهة بالجزر للأغراض التجريبية. في صفيحة 6 آبار ، يتكون البئر الواحد الذي يزيد عن 80٪ من التقاء 2-2.3 مليون hPSCs. في حين أن التنبؤ الدقيق يمثل تحديا بسبب الاختلافات في خطوط hPSC وكفاءة التمايز ، فإن التقدير التقريبي هو 1.5 ضعف عدد الآبار الأولية. عادة ما ينتج عن التمايز الموجه بشكل فعال 1.6 إلى 2 مليون خلية لكل بئر في ألواح من ستة آبار ، تشمل جميع الخلايا داخل المجموعات بدلا من الخلايا المنتجة للأنسولين حصريا. بالنسبة لمجموعة 50 ميكرومتر ، يمكن تقريبها لتحتوي على حوالي 10000 خلية. يقدم الجدول 1 ملخصا لتكوين الوسائط المستخدم لكل يوم / مرحلة من مراحل التمايز الموجه أعلى مصفوفة الخلا....

النتائج

يقدم البروتوكول الموصوف في هذه الورقة نهجا عالي الكفاءة للتمييز بين الخلايا الشبيهة ب β من hPSCs10. تستخدم هذه العملية نظام ثقافة 2D قابل للتطوير بسهولة ، مما يتيح استخدامه في بيئات تجريبية مختلفة ، مثل تمايز التعلم ، والمشاريع الصغيرة والمختبرات ، والاختبارات التجريبية لتقييم إ.......

Discussion

يعتمد التمايز الناجح ل hPSCs إلى خلايا β البنكرياس على تحسين جميع جوانب الزراعة الروتينية ومرور hPSCs المختارة. وهذا يشمل التأكد من أن خط الخلية لديه نمط نووي طبيعي ، وسلبي لعدوى الميكوبلازما ، وخالي من جينومات البلازميد أو الناقل الفيروسي. علاوة على ذلك ، عند استخدام hiPSCs ، من المهم تجنب استخدا.......

Acknowledgements

تم دعم إيناس الشرقاوي من قبل منحة دراسية لمرض السكري في المملكة المتحدة (BDA 18/0005934) إلى GAR ، التي تشكر أيضا Wellcome Trust لجائزة الباحث (212625 / Z / 18 / Z) ، UKRI MRC لمنحة البرنامج (MR / R022259 / 1) ، Diabetes UK لمنحة المشروع (BDA16 / 0005485) ، CRCHUM لصناديق بدء التشغيل ، Innovation Canada لجائزة John R. Evans Leader (CFI 42649) ، NIH-NIDDK (R01DK135268) للحصول على منحة مشروع، ومركز القاهرة لحقوق الإنسان، JDRF للحصول على منحة الفريق (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). كاميل ديون والدكتور هاري ليتش لمساعدتهما في توليد وثقافة hiPSCs البشرية ، منشأة NIHR Imperial BRC (مركز البحوث الطبية الحيوية) العضوية ، لندن.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

References

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. <....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved