بروتوكول محسن لتوليد خلايا إفراز الأنسولين البنكرياسية الوظيفية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتمايز الموجه والتحليل الوظيفي للخلايا الشبيهة بالخلايا β. نحن نصف ظروف وممرات الثقافة المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات قبل توليد خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. يتطور التمايز المكون من ست مراحل من تكوين الأديم الباطن النهائي إلى خلايا وظيفية تشبه الخلايا β تفرز الأنسولين استجابة للجلوكوز.

Abstract

يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى أي نوع من الخلايا ، مما يجعلها مصدرا بديلا ممتازا لخلايا β البنكرياس البشرية. يمكن أن تكون hPSCs إما خلايا جذعية جنينية (hESCs) مشتقة من الكيسة الأريمية أو خلايا مستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) متولدة مباشرة من الخلايا الجسدية باستخدام عملية إعادة البرمجة. هنا يتم تقديم بروتوكول قائم على الفيديو لتحديد الثقافة المثلى وظروف المرور ل hPSCs ، قبل تمايزها وتوليدها لاحقا لخلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. تتبع هذه المنهجية العملية المكونة من ست مراحل للتمايز الموجه للخلايا β ، حيث تتمايز hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وأنبوب الأمعاء البدائي ، ومصير الأمعاء الأمامية الخلفية ، وأسلاف البنكرياس ، وأسلاف الغدد الصماء في البنكرياس ، وفي النهاية خلايا β البنكرياس. من الجدير بالذكر أن منهجية التمايز هذه تستغرق فترة 27 يوما لتوليد خلايا β البنكرياس البشرية. تم تقييم إمكانات إفراز الأنسولين من خلال تجربتين ، والتي تضمنت التلوين المناعي وإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.

Introduction

تتمتع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بقدرة فريدة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مما يجعلها بديلا قابلا للتطبيق لخلايا β البنكرياس البشرية¹. يتم تصنيف هذه hPSCs إلى نوعين: الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) ، المشتقة من الكيسة الأريمية² ، والخلايا المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) ، الناتجة عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية مباشرة³. إن تطوير تقنيات للتمييز بين hPSCs إلى خلايا β ، له آثار مهمة على كل من البحث الأساسي والممارسة السريرية ^1,4. داء السكري هو مرض مزمن يصيب > 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وينتج عن عدم قدر....

Protocol

قبل البدء في التمايز ، يوصى بتحديد العدد المطلوب من الكائنات العضوية الشبيهة بالجزر للأغراض التجريبية. في صفيحة 6 آبار ، يتكون البئر الواحد الذي يزيد عن 80٪ من التقاء 2-2.3 مليون hPSCs. في حين أن التنبؤ الدقيق يمثل تحديا بسبب الاختلافات في خطوط hPSC وكفاءة التمايز ، فإن التقدير التقريبي هو 1.5 ضعف عدد الآبار الأولية. عادة ما ينتج عن التمايز الموجه بشكل فعال 1.6 إلى 2 مليون خلية لكل بئر في ألواح من ستة آبار ، تشمل جميع الخلايا داخل المجموعات بدلا من الخلايا المنتجة للأنسولين حصريا. بالنسبة لمجموعة 50 ميكرومتر ، يمكن تقريبها لتحتوي على حوالي 10000 خلية. يقدم الجدول 1 ملخصا لتكوين الوسائط المستخدم لكل يوم / مرحلة من مراحل التمايز الموجه أعلى مصفوفة الخلا....

النتائج

يقدم البروتوكول الموصوف في هذه الورقة نهجا عالي الكفاءة للتمييز بين الخلايا الشبيهة ب β من hPSCs¹⁰. تستخدم هذه العملية نظام ثقافة 2D قابل للتطوير بسهولة ، مما يتيح استخدامه في بيئات تجريبية مختلفة ، مثل تمايز التعلم ، والمشاريع الصغيرة والمختبرات ، والاختبارات التجريبية لتقييم إ.......

Discussion

يعتمد التمايز الناجح ل hPSCs إلى خلايا β البنكرياس على تحسين جميع جوانب الزراعة الروتينية ومرور hPSCs المختارة. وهذا يشمل التأكد من أن خط الخلية لديه نمط نووي طبيعي ، وسلبي لعدوى الميكوبلازما ، وخالي من جينومات البلازميد أو الناقل الفيروسي. علاوة على ذلك ، عند استخدام hiPSCs ، من المهم تجنب استخدا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750