A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتمايز الموجه والتحليل الوظيفي للخلايا الشبيهة بالخلايا β. نحن نصف ظروف وممرات الثقافة المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات قبل توليد خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. يتطور التمايز المكون من ست مراحل من تكوين الأديم الباطن النهائي إلى خلايا وظيفية تشبه الخلايا β تفرز الأنسولين استجابة للجلوكوز.
يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى أي نوع من الخلايا ، مما يجعلها مصدرا بديلا ممتازا لخلايا β البنكرياس البشرية. يمكن أن تكون hPSCs إما خلايا جذعية جنينية (hESCs) مشتقة من الكيسة الأريمية أو خلايا مستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) متولدة مباشرة من الخلايا الجسدية باستخدام عملية إعادة البرمجة. هنا يتم تقديم بروتوكول قائم على الفيديو لتحديد الثقافة المثلى وظروف المرور ل hPSCs ، قبل تمايزها وتوليدها لاحقا لخلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. تتبع هذه المنهجية العملية المكونة من ست مراحل للتمايز الموجه للخلايا β ، حيث تتمايز hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وأنبوب الأمعاء البدائي ، ومصير الأمعاء الأمامية الخلفية ، وأسلاف البنكرياس ، وأسلاف الغدد الصماء في البنكرياس ، وفي النهاية خلايا β البنكرياس. من الجدير بالذكر أن منهجية التمايز هذه تستغرق فترة 27 يوما لتوليد خلايا β البنكرياس البشرية. تم تقييم إمكانات إفراز الأنسولين من خلال تجربتين ، والتي تضمنت التلوين المناعي وإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.
تتمتع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بقدرة فريدة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مما يجعلها بديلا قابلا للتطبيق لخلايا β البنكرياس البشرية1. يتم تصنيف هذه hPSCs إلى نوعين: الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) ، المشتقة من الكيسة الأريمية2 ، والخلايا المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) ، الناتجة عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية مباشرة3. إن تطوير تقنيات للتمييز بين hPSCs إلى خلايا β ، له آثار مهمة على كل من البحث الأساسي والممارسة السريرية 1,4. داء السكري هو مرض مزمن يصيب > 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وينتج عن عدم قدر....
قبل البدء في التمايز ، يوصى بتحديد العدد المطلوب من الكائنات العضوية الشبيهة بالجزر للأغراض التجريبية. في صفيحة 6 آبار ، يتكون البئر الواحد الذي يزيد عن 80٪ من التقاء 2-2.3 مليون hPSCs. في حين أن التنبؤ الدقيق يمثل تحديا بسبب الاختلافات في خطوط hPSC وكفاءة التمايز ، فإن التقدير التقريبي هو 1.5 ضعف عدد الآبار الأولية. عادة ما ينتج عن التمايز الموجه بشكل فعال 1.6 إلى 2 مليون خلية لكل بئر في ألواح من ستة آبار ، تشمل جميع الخلايا داخل المجموعات بدلا من الخلايا المنتجة للأنسولين حصريا. بالنسبة لمجموعة 50 ميكرومتر ، يمكن تقريبها لتحتوي على حوالي 10000 خلية. يقدم الجدول 1 ملخصا لتكوين الوسائط المستخدم لكل يوم / مرحلة من مراحل التمايز الموجه أعلى مصفوفة الخلا....
يقدم البروتوكول الموصوف في هذه الورقة نهجا عالي الكفاءة للتمييز بين الخلايا الشبيهة ب β من hPSCs10. تستخدم هذه العملية نظام ثقافة 2D قابل للتطوير بسهولة ، مما يتيح استخدامه في بيئات تجريبية مختلفة ، مثل تمايز التعلم ، والمشاريع الصغيرة والمختبرات ، والاختبارات التجريبية لتقييم إ.......
يعتمد التمايز الناجح ل hPSCs إلى خلايا β البنكرياس على تحسين جميع جوانب الزراعة الروتينية ومرور hPSCs المختارة. وهذا يشمل التأكد من أن خط الخلية لديه نمط نووي طبيعي ، وسلبي لعدوى الميكوبلازما ، وخالي من جينومات البلازميد أو الناقل الفيروسي. علاوة على ذلك ، عند استخدام hiPSCs ، من المهم تجنب استخدا.......
تم دعم إيناس الشرقاوي من قبل منحة دراسية لمرض السكري في المملكة المتحدة (BDA 18/0005934) إلى GAR ، التي تشكر أيضا Wellcome Trust لجائزة الباحث (212625 / Z / 18 / Z) ، UKRI MRC لمنحة البرنامج (MR / R022259 / 1) ، Diabetes UK لمنحة المشروع (BDA16 / 0005485) ، CRCHUM لصناديق بدء التشغيل ، Innovation Canada لجائزة John R. Evans Leader (CFI 42649) ، NIH-NIDDK (R01DK135268) للحصول على منحة مشروع، ومركز القاهرة لحقوق الإنسان، JDRF للحصول على منحة الفريق (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). كاميل ديون والدكتور هاري ليتش لمساعدتهما في توليد وثقافة hiPSCs البشرية ، منشأة NIHR Imperial BRC (مركز البحوث الطبية الحيوية) العضوية ، لندن.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Ethanol | VWR | 20821.33 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved