Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peuvent se différencier en n’importe quel type de cellule, ce qui en fait une excellente source alternative de β-cellules pancréatiques humaines. Les CSPh peuvent être soit des cellules souches embryonnaires (CSEh) dérivées du blastocyste, soit des cellules pluripotentes induites (CSPh) générées directement à partir de cellules somatiques par un processus de reprogrammation. Ici, un protocole vidéo est présenté pour décrire les conditions optimales de culture et de passage des hPSC, avant leur différenciation et la génération ultérieure de cellules pancréatiques productrices d’insuline. Cette méthodologie suit le processus en six étapes de différenciation dirigée par les cellules β, dans lequel les hPSC se différencient en endoderme définitif (DE), tube intestinal primitif, destin de l’intestin antérieur postérieur, progéniteurs pancréatiques, progéniteurs endocriniens pancréatiques et finalement cellules β pancréatiques. Il convient de noter que cette méthodologie de différenciation prend une période de 27 jours pour générer des β-cellules pancréatiques humaines. Le potentiel de sécrétion d’insuline a été évalué par le biais de deux expériences, qui comprenaient l’immunomarquage et la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) ont la capacité unique de se différencier en différents types de cellules, ce qui en fait une alternative viable aux cellules β pancréatiques humaines¹. Ces hPSC sont classées en deux types : les cellules souches embryonnaires (hESC), dérivées du blastocyste², et les cellules pluripotentes induites (hiPSC), générées par la reprogrammation directe des cellules somatiques³. Le développement de techniques permettant de différencier les CSPh en cellules β a des implications importantes pour la recherche fondamentale et la pratique clinique

Protocole

Avant d’amorcer la différenciation, il est recommandé de déterminer le nombre requis d’organoïdes en forme d’îlots à des fins expérimentales. Dans une plaque à 6 puits, un seul puits avec plus de 80 % de confluence se compose généralement de 2 à 2,3 millions de CSPh. Bien qu’une prédiction précise soit difficile en raison des variations des lignées de hPSC et de l’efficacité de la différenciation, une estimation approximative est 1,5 fois le nombre de puits initiaux. Une différenciation dirigée efficacement produit généralement 1,6 à 2 millions de cellules par puits dans des plaques à six puits, englobant toutes les cellules des grappes plutôt que exclusivement les ce....

Discussion

La différenciation réussie des CSPh en cellules β pancréatiques dépend de l’optimisation de tous les aspects de la culture de routine et du passage des CSPh sélectionnées. Il s’agit notamment de s’assurer que la lignée cellulaire a un caryotype normal, qu’elle est négative pour l’infection à mycoplasmes et qu’elle est exempte de génomes plasmidiques ou de vecteurs viraux. De plus, lors de l’utilisation de hiPSC, il est important d’éviter d’utiliser le passage le plus ancien qui est encore en.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750