ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

要約

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、あらゆる種類の細胞に分化できるため、ヒト膵臓β細胞の優れた代替供給源となっています。ヒトPS細胞は、胚盤胞由来の胚性幹細胞(hESC)と、リプログラミングプロセスを用いて体細胞から直接作製した人工多能性細胞(iPS細胞)のいずれかです。ここでは、hPS細胞の分化とその後のインスリン産生膵細胞の生成前の最適な培養および継代条件を概説するために、ビデオベースのプロトコルを紹介します。この方法論は、ヒトPS細胞が最終内胚葉(DE)、原始腸管、後部前腸運命、膵前駆細胞、膵臓内分泌前駆細胞、そして最終的に膵β細胞に分化する、β細胞指向性分化の6段階のプロセスに従います。この分化法は、ヒト膵臓β細胞を生成するのに27日かかることは注目に値します。インスリン分泌の可能性は、免疫染色とグルコース刺激インスリン分泌を含む2つの実験を通じて評価されました。

概要

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、さまざまな細胞型に分化する独自の能力を有しており、ヒト膵臓β細胞の代替として有力な存在となっています¹。これらのヒトPS細胞は、胚盤胞に由来する胚性幹細胞(hESC)^2と、体細胞を直接リプログラミングして作製した人工多能性細胞(iPS細胞⁾³の2種類に分類されます。ヒトPS細胞をβ細胞に分化させる技術の開発は、基礎研究と臨床の両面で重要な意味を持ちます^1,4。糖尿病は、世界中で4億>人が罹患している慢性疾患であり、膵臓^{β細胞の機能}不全または喪失により、体が血糖を調節できないことに起因します5。移植用の膵島細胞の利用可能性が限られているため、糖尿病の細胞補充療法の開発が妨げられています^2,4,6,7。ヒトPS細胞を用いてグルコース応答性インスリン分泌細胞を作製できることは、ヒト膵島の発生と機能を研究するための有用な細胞モデルとして有用です。また....

プロトコル

分化を開始する前に、実験目的で必要な膵島様オルガノイドの数を決定することが推奨されます。6ウェルプレートでは、コンフルエントが80%を超える1つのウェルは、通常、200万〜230万個のhPS細胞で構成されています。hPSC株のばらつきや分化効率などにより、正確な予測は困難ですが、大まかな推定では初期ウェル数の1.5倍です。効果的に方向づけられた分化では、通常、インスリン産生細胞のみではなく、クラスター内のすべての細胞を含む6ウェルプレートでウェルあたり1.6〜200万個の細胞が得られます。50 μmのクラスターの場合、約10,000個の細胞を含むように近似できます。 表1 に、グルコース刺激インスリン分泌バッファーとともに、幹細胞マトリックスおよび培地上での指向性分化の各日/段階に使用した培地組成の概要を示します。

1. ヒト多能性幹細胞の分化前を6ウェルプレートで継代

注:β細胞様細胞に分化する前にヒト幹細胞を適切に継代することは、実験プロセスを確立する上で重要なステップです。継代希釈や接着細胞数が正しくないと、分化効率と忠実度が損なわれる可能性があります。

1. 幹細胞培養培地、コーティング液、および解離溶液を調製します( 表1に規定)。
2. 継代の1〜2時間前に、6ウェルプレートにコー....

ディスカッション

ヒトPS細胞の膵β細胞への分化が成功するかどうかは、選択したヒトPS細胞の日常的な培養と継代のあらゆる側面を最適化することにかかっています。これには、細胞株が正常な核型を持ち、マイコプラズマ感染が陰性であり、プラスミドまたはウイルスベクターゲノムがないことが含まれます。また、iPS細胞を用いる場合、まだリプログラミング中の最も早い継代をパイロット実験に用いる?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750