Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula, rendendole un'eccellente fonte alternativa di cellule β pancreatiche umane. Le hPSC possono essere cellule staminali embrionali (hESC) derivate dalla blastocisti o cellule pluripotenti indotte (hiPSC) generate direttamente da cellule somatiche utilizzando un processo di riprogrammazione. Qui viene presentato un protocollo basato su video per delineare le condizioni ottimali di coltura e passaggio per le hPSC, prima della loro differenziazione e della successiva generazione di cellule pancreatiche produttrici di insulina. Questa metodologia segue il processo in sei fasi per la differenziazione diretta a β cellule, in cui le hPSC si differenziano in endoderma definitivo (DE), tubo intestinale primitivo, destino dell'intestino anteriore posteriore, progenitori pancreatici, progenitori endocrini pancreatici e, infine, cellule β pancreatiche. È interessante notare che questa metodologia di differenziazione impiega un periodo di 27 giorni per generare cellule β pancreatiche umane. Il potenziale della secrezione di insulina è stato valutato attraverso due esperimenti, che includevano l'immunocolorazione e la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) hanno la capacità unica di differenziarsi in vari tipi di cellule, il che le rende una valida alternativa alle cellule β pancreatiche umane¹. Queste hPSC sono classificate in due tipi: cellule staminali embrionali (hESCs), derivate dalla blastocisti², e cellule pluripotenti indotte (hiPSCs), generate dalla riprogrammazione diretta delle cellule somatiche³. Lo sviluppo di tecniche per differenziare le hPSC in cellule β ha importanti implicazioni sia per la ricerca di base che per la pratica clinica ^1,4

Protocollo

Prima di iniziare la differenziazione, si raccomanda di determinare il numero richiesto di organoidi simili a isole per scopi sperimentali. In una piastra a 6 pozzetti, un singolo pozzetto con una confluenza superiore all'80% è in genere costituito da 2-2,3 milioni di hPSC. Mentre una previsione accurata è difficile a causa delle variazioni nelle linee hPSC e nell'efficienza di differenziazione, una stima approssimativa è 1,5 volte il numero di pozzi iniziali. Una differenziazione diretta in modo efficace di solito produce da 1,6 a 2 milioni di cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti, comprendendo tutte le cellule all'interno dei cluster piuttosto che esclusiva....

Discussione

Il successo della differenziazione delle hPSC in cellule β pancreatiche dipende dall'ottimizzazione di tutti gli aspetti della coltura e del passaggio di routine delle hPSC selezionate. Ciò include la garanzia che la linea cellulare abbia un cariotipo normale, sia negativa per l'infezione da micoplasma e sia priva di genomi plasmidici o vettori virali. Inoltre, quando si utilizzano le hiPSC, è importante evitare di utilizzare i primi passaggi, che sono ancora in fase di riprogrammazione, per esperimenti pilota. Questi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750