İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

Özet

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

Özet

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) her tür hücreye farklılaşabilir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerinin mükemmel bir alternatif kaynağı haline getirir. hPSC'ler, blastosistten türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) veya bir yeniden programlama işlemi kullanılarak doğrudan somatik hücrelerden üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler) olabilir. Burada, farklılaşmadan ve daha sonra insülin üreten pankreas hücrelerinin oluşturulmasından önce hPSC'ler için optimal kültür ve geçiş koşullarını ana hatlarıyla belirtmek için video tabanlı bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hPSC'lerin kesin endoderm (DE), ilkel bağırsak tüpü, posterior ön bağırsak kaderi, pankreas progenitörleri, pankreas endokrin progenitörleri ve nihayetinde pankreas β hücrelerine farklılaştığı β hücreye yönelik farklılaşma için altı aşamalı süreci takip eder. Bu farklılaşma metodolojisinin insan pankreas β hücrelerini oluşturmak için 27 günlük bir süre alması dikkat çekicidir. İnsülin sekresyonunun potansiyeli, immün boyama ve glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonunu içeren iki deneyle değerlendirildi.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), çeşitli hücre tiplerine farklılaşma konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerine uygun bir alternatif haline getirir¹. Bu hPSC'ler iki tipe ayrılır: blastosist^2'den türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) ve somatik hücrelerin doğrudan yeniden programlanmasıyla üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler)³. hPSC'leri β hücrelere ayırma tekniklerinin geliştirilmesi, hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için önemli etkilere sahiptir ^1,4. Diabetes mellitus, dünya çapında >400 milyon insanı etkileyen kronik bir hastalıktır ve vücudun pankreas β hücrelerinin bozulması veya kaybı nedeniyle glisemiyi düzenleyememesinden kaynaklanır⁵. Transplantasyon için pankreas adacık hücrelerinin sınırlı mevcudiyeti, diyabet^için hücre replasman tedavilerinin geliştirilmesini engellemiştir 2,4,6,7. hPSC'leri kullanarak glikoza duyarlı insülin salgılayan hücreler üretme yeteneği, insan adacık gelişimini ve işlevini incelemek için yararlı bir hücresel model görevi görür. Kontrollü bir ortamda diyabet tedavisi için potansiyel terapötik adayları test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, hPSC'ler, hastayla genetik olarak özdeş olan pankreas adacık hücreleri üretme potansiyeline sahiptir ve transplantasyondan sonra immün reddi riskini azaltır ^2,4,7.

Son yıllarda, hPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin iyileştirilmesinde önemli ilerlemeler olmuştur, bu da pankreas β hücreleri üretmeye yönelik farklılaşma sürecinin verimliliğinin ve tekrarlanabilirliğinin artmasına neden olmuştur ^8,9.

Aşağıdaki protokol, pankreas β hücrelerinin yönlendirilmiş farklılaşmasının temel aşamalarını özetlemektedir. Farklı zaman noktalarında spesifik hücre sinyal yollarının düzenlenmesini içerir. Sui L. ve ^ark.10 (2018) tarafından hPSC'lerin pankreas β hücrelerine dönüştürülmesi için geliştirilen protokole dayanmaktadır. En son araştırmalar, β hücrelerinin farklılaşmasını artırmak için aphidicolin (APH) tedavisinin kullanılmasının önemini vurguladığından, protokol Sui L. ve ^ark.11'in (2021) son güncellemelerine göre ayarlandı. Mevcut protokol, sürecin sonraki aşamalarında ortama APH eklenmesini içerir. Ayrıca, ilk protokole kıyasla farklılaşmanın erken aşamalarında ortamın bileşiminde değişiklikler yapılmıştır. Dikkate değer bir değişiklik, 6. günde Keratinosit Büyüme Faktörü (KGF) eklenmesi ve 8. güne kadar devam etmesidir. Keratinosit büyüme faktörü (KGF), 6. günden 8. güne kadar verilir ve bu, KGF'nin evre 4 ortamına dahil edilmediği ilk protokol^10'dan biraz farklıdır.

β hücreli hücrelerin oluşumundaki ilk ve temel adım, hPSC'lerin, pankreas da dahil olmak üzere çeşitli organların epitel astarına yol açan ilkel bir germ tabakası olan kesin endoderm'e (DE) yönlendirilmiş farklılaşmasıdır. DE oluşumundan sonra, hücreler ilkel bağırsak tüpüne farklılaşır ve bunu posterior ön bağırsak kaderinin belirlenmesi izler. Posterior ön bağırsak daha sonra endokrin ve ekzokrin hücreler de dahil olmak üzere pankreasın tüm hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahip pankreas progenitör hücrelerine dönüşür. Süreçteki bir sonraki aşama, Langerhans adacıklarında bulunan hormon salgılayan hücrelere yol açan pankreas endokrin progenitörlerini içerir. Sonunda, farklılaşma süreci, tamamen işlevsel pankreas β hücresi benzeri hücreler^üreterek son aşamasına ulaşır ^9,10. Bu işlemin karmaşık olduğunu ve farklılaşmanın etkinliğini ve özgüllüğünü artırmak için spesifik büyüme faktörleri ve hücre dışı matris bileşenleri gibi kültür koşullarının optimizasyonunu gerektirdiğini^{belirtmek önemlidir 9,10}. Ayrıca, in vitro olarak hPSC'lerden fonksiyonel β hücre benzeri hücreler üretmek hala büyük bir zorluktur. Devam eden araştırmalar, farklılaşma protokollerini geliştirmeye ve ortaya çıkan β hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini geliştirmeye odaklanmaktadır⁹.

Bu protokolde, hPSC'lerin kültürü ve geçişi sırasında nazik hücre ayrışmasının kullanılması, hücre canlılığını ve pluripotentliği korumak için esastır ve pankreas β hücrelerine farklılaşma etkinliğini önemli ölçüde artırır. Ek olarak, her aşamaya özgü ortam, insan adacığına çok benzeyen kümelerde yüksek miktarda insülin salgılayan hücre verimini teşvik etmek için Sui L. ve ^ark.10 tarafından geliştirilen protokol izlenerek titizlikle optimize edilmiştir.

Protokol

Farklılaşmaya başlamadan önce, deneysel amaçlar için gerekli sayıda adacık benzeri organoidin belirlenmesi önerilir. 6 oyuklu bir plakada, %80'in üzerinde birleşmeye sahip tek bir kuyu tipik olarak 2-2,3 milyon hPSC'den oluşur. hPSC hatlarındaki farklılıklar ve farklılaşma verimliliği nedeniyle doğru bir tahmin zor olsa da, kaba bir tahmin, ilk kuyu sayısının 1,5 katıdır. Etkili bir şekilde yönlendirilmiş bir farklılaşma, genellikle altı oyuklu plakalarda oyuk başına 1.6 ila 2 milyon hücre verir ve yalnızca insülin üreten hücrelerden ziyade kümeler içindeki tüm hücreleri kapsar. 50 μm'lik bir küme için, yaklaşık 10.000 hücre içerecek şekilde tahmin edilebilir. Tablo 1 , glikoz ile uyarılan insülin sekresyon tamponu ile birlikte, kök hücre matrisi ve ortamının üzerinde yönlendirilmiş farklılaşmanın her günü/aşaması için kullanılan ortam bileşiminin bir özetini sağlar.

1. İnsan pluripotent kök hücrelerinin 6 oyuklu plakalarda farklılaşmadan önce geçirilmesi

NOT: İnsan kök hücrelerinin β hücre benzeri hücrelere farklılaşmadan önce uygun şekilde geçirilmesi, deneysel sürecin oluşturulmasında çok önemli bir adımdır. Yanlış geçiş seyreltmesi veya bağlantı hücre numarası, farklılaşma verimliliğini ve aslına uygunluğu tehlikeye atabilir.

1. Kök hücre kültürü ortamı, kaplama ve ayrışma solüsyonları hazırlayın ( Tablo 1'de belirtildiği gibi).
2. Geçişten 1-2 saat önce, altı oyuklu bir plakayı soğuk kaplama çözeltisi (oyuk başına 1 mL) ile kaplayın ve 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
3. Kök hücre kültürü ortamının bir kısmını oda sıcaklığında (15-25 °C) 20 dakika ısıtın.
4. Kök hücre ortamını aspire edin ve 1 mL kalsiyum/magnezyum içermeyen D-PBS ekleyin.
5. Adım 1.4'ü tekrarlayın. Iki kez.
   NOT: D-PBS, hücreleri yıkamak ve önceki ortamı ve bileşikleri çıkarmak için eklenir. D-PBS'ye maruz kalmak hPSC'lere zarar vermediğinden, ozmozun neden olduğu hücre yırtılmasını veya büzülmesini önlediğinden, yıkama adımları için belirli bir zaman çerçevesine gerek olmadığına dikkat etmek önemlidir.
6. D-PBS'yi aspire edin, her kuyucuk için 500 μL ayrışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında (15 - 25 °C) 2-5 dakika bekletin.
7. Hücreler ayrışırken, yeni 6 oyuklu plakanın kaplama solüsyonunu aspire edin ve her oyuğa 1-2 mL kalsiyum / magnezyum içermeyen D-PBS ekleyin.
8. Ters mikroskop altında ayrışma sürecini düzenli olarak kontrol edin.
9. Hücrelerin% 80 - 90'ı yuvarlatıldığında, ancak hala yapışkan olduğunda ayrışma çözeltisini aspire edin.
10. 10 μM ROCK inhibitörü içeren kök hücre ortamından 1 mL ekleyin.
11. Ayrışmış hücreleri 1.000 μL steril filtreli pipet uçları ve bir P1000 pipet kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
12. Kolonileri kırmak için 1.000 μL steril pipet filtreli uçla hücre süspansiyonunu pipette yavaşça yukarı ve aşağı ezin, ancak 10 katı geçmeyin.
13. Kalan hPSC'lerin ayrılmasına yardımcı olmak için ROCK inhibitörü içeren kök hücre ortamından 1 mL ekleyin ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mL konik tüpe aktarın (1.10).
14. D-PBS'yi yeni kaplanmış plakadan aspire edin ve hemen 15 mL'lik konik tüpten hücre süspansiyonunu ekleyin. Optimum hücre büyümesini sağlamak için, 6 oyuklu bir plaka (10'da 1 ila 50'de 1) kullanırken oyuk başına 2 x 10^5-1 x 10⁶ canlı hücre aralığını tohumlayın.
    NOT: Hacim hesaplaması için, 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu, ROCK inhibitörlü 2 mL kök hücre ortamı içermelidir.
15. Plakayı hızlı bir şekilde ileri geri ve 5 - 10 kez yan yana hareket ettirin.
16. Plakayı 37 °C'de, %5_CO2 inkübatörde 24 saat yerleştirin.
17. Ertesi gün ROCK inhibitörü içermeyen taze kök hücre besiyeri ile değiştirin ve daha sonra hPSC'lerin birleşmesi% 80 - 95'e ulaşana kadar her 2 günde bir.

2. İnsan kök hücresi kaynaklı β hücrelerine yönelik farklılaşma

NOT: hPSC'ler,% 80-95 birleşme sağlandığında pankreas β hücrelerine doğrudan farklılaşma işlemi için kullanılabilir.

1. Gün -1: Hücrelerin geçişi Farklılaşmanın -1. günü:
   1. Geçişten 1-2 saat önce, 6 oyuklu bir plakayı 37 °C,% 5_CO2 inkübatörde 1 saat boyunca soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın.
   2. 1.1'den 1.10'a kadar olan adımları izleyin ve hücreleri saymaya devam edin.
   3. 10 μL hücre karışımı yükleyin, eşit hacimde Tripan Mavisi ekleyin ve hafifçe karıştırın.
   4. Hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Kaplanmış 6 oyuklu plakayı oyuk başına 2 mL ortam ile kaplamak için 10 μM ROCK inhibitörü içeren 0.8 × 10 6 hücre / mL - 1.0 x 10⁶ hücre / mL kök hücre ortamı kullanın.
   5. Plakayı üç kez yan yana hızlı bir şekilde ileri geri hareket ettirin.
   6. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin. Plakayı hızlı bir şekilde ileri geri ve 10 kez tekrar yan yana hareket ettirin. Ardından plakayı 4 saat inkübe edin.
      NOT: İnkübatöre yerleştirildikten sonra plakayı hareket ettirerek hücrelerin maksimum bağlantısının ve eşit dağılımının hücreleri rahatsız etmediğinden emin olun. İnkübatörü çok dikkatli bir şekilde açın ve kapatın.
   7. Bazal ortam şişesini 0 ila 4. günler için 4 ° C'de gece boyunca eritmek için yerleştirin.
2. Gün 0
   NOT: hPSC'ler %80 - 95 birleşim şeklinde olmalıdır, bu birleşim altında kesin endoderm için farklılaşma sürecini başlatmayın.
   1. Buz üzerinde, hem 0 ila 4. günler için bazal ortamı hem de takviyeleri çözün (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. İki konik tüpte sadece 1. günde kullanılacak gerekli hacmi hazırlayın (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) ve ayrı bir tüpte, 2.5 ila 4. gün için hacmi iki katına çıkarın (2 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 x 6 mL). Gün 2.5 ila Gün 4 ortamını 4 °C'de saklayın.
   3. Gün 1 ortamı ve yıkama ortamı 1'in gerekli hacminde bir alikotu 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ısıtın.
   4. Kök hücre ortamını aspire edin ve 2 mL yıkama ortamı ekleyin 1.
      NOT: Protokolde kullanılan yıkama besiyeri, %1 antibiyotik ile desteklenmiş, her güne/evreye özgü bazal besiyerinden oluşur. Doğrudan farklılaştırma protokolünün yıkama adımları, yalnızca belirtilen yıkama ortamının ("yıkama ortamı 1 veya 2", Malzeme Tablosu olarak anılır) eklenmesini ve ardından açıklanan prosedür 2.2.4'ü izleyerek aspirasyonu içerir. Bu yıkama adımları için belirtilen belirli bir zaman dilimi olmadığını belirtmek önemlidir.
   5. Yıkama ortamı 1'i aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL Gün 1 ortamı ekleyin.
   6. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO₂ 'de 24 saat inkübe edin.
3. 1. Gün
   1. 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca gerekli hacimde 2,5 ila 4 orta miktarda bir alikotu önceden ısıtın.
   2. Gün 1 ortamını aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2.5 ila 4 orta günün 2 mL'sini ekleyin. Hücreleri yıkamayın.
   3. Plakayı 36 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
4. Günler 2,5 ila 4
   1. Günün kalan hacminin bir kısmını 2,5 ila 4 orta boy 37 °C su banyosunda 5 dakika önceden ısıtın.
   2. Ortamı aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL taze hazırlanmış Gün 2.5 ila 4 orta ekleyin.
   3. Plakayı 36 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
5. 4. Gün
   NOT: Bu aşamada, kesin endoderm belirteçlerinin ekspresyonu maksimumdadır ve hücreler ilkel bağırsak tüpü farklılaşmasını başlatabilir.
   1. 4. Gün ilkel bağırsak aşaması ortamının (altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) gerekli hacminin bir alikotunu hazırlayın ve oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. Aspire Günleri 2,5 ila 4 orta ve 2 mL yıkama ortamı ekleyin 1.
   3. Yıkama ortamını 1 aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL 4. gün ilkel bağırsak aşaması ekleyin.
   4. Plakayı 48 saat boyunca 37 °C ve %5_CO2'ye geri yerleştirin.
6. 6 ila 8. Günler
   NOT: Bu aşamada, hücreler posterior ön bağırsak kaderi üzerinde daha fazla farklılaşma başlatır.
   1. Gerekli hacim 6 ila 8 posterior foregut ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) hazırlayın ve ortamı oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. 4. Gün ortamını aspire edin ve hemen kuyunun kenarına 2 mL 6 ila 8 arka ön bağırsak ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 48 saat boyunca% 5 CO₂ içeren 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
7. 8 ila 12. Günler
   NOT: Hücreler pankreas progenitörlerinin farklılaşmasına hazırdır.
   1. Gerekli hacim 8 ila 12 gün pankreas progenitörleri sahne ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) hazırlayın ve ortamı oda sıcaklığında (15 °C -25 °C) 20 dakika ısıtın.
   2. 6 ila 8 orta günleri aspire edin ve hemen kuyu kenarına 2 mL 6 ila 8 arka ön bağırsak ortamı ekleyin.
   3. Plakayı 37 °C'de 48 saat boyunca %5_CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin.
8. 12. Gün: Kümeleme adımını gerçekleştirme
   NOT: Bu aşamada, hücreler yoğun bir tek tabaka oluşturur ve kümeler oluşturmak için 3D hücre kültürüne geçirilir. Bu adım, β benzeri hücrelerin doğal insan adacıklarına yapısal benzerliğini arttırmak için farklılaşma için çok önemlidir, ancak aynı zamanda hem hücresel hem de küme seviyelerinde işlevsel benzerliklerini geliştirir¹¹ (Şekil 1).
   1. Oda sıcaklığında (15 °C - 25 °C) 2 mL yapışma önleyici durulama solüsyonu ile 400 μm'lik mikro kuyular içeren 6 oyuklu bir plakaya (Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi: İnsan Kök Hücresinden Kaynaklı β Hücreler Yönlendirilmiş Farklılaşma, Gün 12) muamele edin.
      NOT: Mikro kuyu, hücrelerin kuyu dibine yapışmasını önler ve 3D kümelerin mekanik oluşumunu kolaylaştırır.
   2. Santrifüj plakasını 1.300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Ters mikroskop altında herhangi bir kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Kabarcık gözlenmezse, yapışma önleyici durulama solüsyonunu aspire edin ve hemen 2 mL yıkama ortamı 2 ekleyin (Malzeme tablosu).
   4. Adım 1.8.3'ü tekrarlayın. iki kez.
   5. Küme ortamının gerekli hacmini hazırlayın ve oda sıcaklığında (15 -25 °C) 20 dakika ısıtın. 6 oyuklu bir plakanın iki oyuğunun, 4 mL küme ortamı ile 400 μm mikro kuyulu 6 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna girdiğinden emin olun.
   6. Pankreas progenitör ortamını aspire edin ve ayrışma tamponu ekleyin (oyuk başına 0.5 mL).
   7. Oda sıcaklığında (15 °C - 25 °C) 2-5 dakika inkübe edin. Ayrışma sürecini ters çevrilmiş bir mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin ve hücrelerin çoğu yuvarlatıldığında, ancak hala yapışkan olduğunda ayrışma tamponunu aspire edin.
   8. Ayrışma tamponunu aspire edin ve hemen her oyuğa 1 mL küme ortamı ekleyin.
   9. P1000 pipet ve 1.000 μL filtre uçları kullanarak altı kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın.
   10. Hücreleri ve küme ortamı karışımını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   11. Kalan tüm hücreleri toplamak için 1 mL küme ortamı ekleyin.
   12. Küme ortamını gereken toplam hacme ekleyin, böylece mikro kuyu plakasının her bir oyuğu 4 mL karışım kümesi ortamına/hücrelerine sahip olur.
   13. Yıkama ortamını 2 mikro kuyulu 6 oyuklu plakadan aspire edin ve hücre süspansiyonunu aktarın. Plakayı 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
9. 13. Gün: Kümelenme sonrası hücrelerin ele alınması ve 13. günden itibaren ortamlarının değiştirilmesi.
   NOT: Kümeler son derece hassastır ve sonraki günlerde bütünlüklerini ve yaşayabilirliklerini sağlamak için dikkatli bir şekilde ele alınmaları gerekir. Bu nedenle, 12. günden sonraki kümelenme sonrası dönemde kümeleri yakından izlemek çok önemlidir. Deneysel süreçte başarılı sonuçları teşvik etmek için düzenli değerlendirme ve ayarlamalar şarttır.
   1. Gerekli hacimde 13 gün ortamı (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mL) ve 15 ila 20 pankreas endokrin progenitör ortamı için 50 mL'lik ayrı bir konik tüpte hazırlayın.
   2. Bir p1000 pipet ve 1.000 μL filtrelenmiş uçlar kullanarak mikro kuyu 6 oyuklu plakadan kümeleri 50 mL'lik bir konik tüpe yavaşça toplayın.
   3. Kalan kümeleri toplamak ve kümeleri tüpe aktarmak için 1 mL Gün 13 ortamı ekleyin.
   4. Hücrelerin yerçekimi altında 5 dakika boyunca konik tüpün dibine doğal olarak oturmasına izin verin.
   5. Hücre kümelerini bozmadan tüpten mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin. Pipet uçları kümelere dokunmamalı veya aspire etmemelidir, sadece süpernatanta dokunmalıdır.
   6. Aşağıdakilere göre gerekli Gün 13 ortamı hacmini ekleyin: 1 kuyucuklu mikro kuyu 6 oyuklu plaka, düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakanın (oyuk başına 2 mL ortam) üç kuyucuğuna gider.
   7. Aspirasyon kümelerinden kaçınarak nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   8. Süspansiyonu çok düşük yapışan 6 oyuklu bir plakaya aktarın.
   9. Plakayı altı kez yan yana hızlı bir şekilde ileri geri hareket ettirin.
   10. Plakayı 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
   11. Bu bölüm 2.9'da açıklandığı gibi, farklılaşmanın sonuna kadar sonraki tüm adımlarda ortam değişikliklerini gerçekleştirin.
10. 15 - 20. Günler
    1. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe toplayarak ve 13. gün için 2.9.4 ila 2.9.10 arasındaki adımları izleyerek, farklılaşmanın 21. gününe kadar her 48 saatte bir pankreas endokrin progenitör evre ortamına geçin.
11. 21-27. Günler
    NOT: Bu aşamada, kümeler pankreas β hücrelerine farklılaşır.
    1. Pankreas β hücreli aşama ortamını hazırlayın.
    2. Ortamı 15 ila 21. günler için açıklandığı gibi iki günde bir değiştirin.
       NOT: 25. günden sonra, adacık benzeri organoidler, tamamen işlevsel olduklarını doğrulamak için analize tabi tutulabilir.

3. Pankreas β hücreli kümelerin boyanması

NOT: Farklılaşma sonrası kümelerin işlevsel değerlendirmesini incelemek için bu adımı gerçekleştirin

1. Farklılaşmanın sonunda 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde beş ila on küme toplayın.
2. Hücre kümelerini oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin.
3. Kümelere 1 mL PBS ekleyin ve kümeleri bozmadan 1.000 μL'lik bir pipet ucuyla PBS'yi çıkarın.
4. Kümelere 200 μL %30 sükroz ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. Kümeleri bir kriyokalıba aktarın, fazla sakkarozu çıkarın, bir damla OCT ortamı ekleyin ve kümeleri OCT ortamı ile karıştırın.
6. Cryomold'u kuru buz üzerinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
7. Bir mikrotom/veya kriyostat kullanarak mikroskop lamları üzerindeki donmuş bloktan 5 μm'lik kesitler kesin.
8. Slaytları lekelenene kadar -80 °C dondurucuda saklayın.
9. Boyama gününde slaytları -80 °C dondurucudan çıkarın.
10. Kriyo kalıbın bölümlerinin etrafındaki buzu dikkatlice çıkarın.
11. Hücre kümelerini hidrofobik bir kalemle slaytlar üzerinde daire içine alın.
12. Slaytları PBS içeren bir slayt boyama kavanozunda 15 dakika boyunca rehidre edin.
13. Slayt boyama kavanozuna soğuk metanol ekleyin ve sürgülü kavanozu -20 °C'de 10 dakika bekletin.
14. Slaytları bir PBS kavanozuna daldırın.
15. Adım 3.14'ü üç kez tekrarlayın.
    NOT: Aşağıdaki tüm yıkama adımları için bu yöntemi kullanın.
16. PBS'yi slaytlardan çıkarın ve PBS-T'de %2-5 BSA içeren 100 μL engelleme solüsyonu ile hemen kapatın.
17. Her slayta engelleme solüsyonu ekleyin ve parafin filmle örtün.
18. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 1 saat inkübe edin.
19. Reaktifler ve Çözeltiler bölümünde verilen oranları kullanarak bloke edici çözeltideki birincil antikorları seyreltin.
20. Engelleme çözümünü slaytlardan çıkarın.
21. Hemen seyreltilmiş antikorlar ekleyin ve slaytın kurumasını önlemek için slaytları parafilm ile örtün.
22. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
23. Ertesi gün slaytları PBS-T ile 3-5 kez yıkayın.
24. Seyreltilmiş ikincil antikorlar ve DNA boyası hazırlayın.
25. Slaytlardan fazla PBS-T'yi çıkarın.
26. Seyreltilmiş ikincil antikorlar ve DNA boyası ekleyin. Oda sıcaklığında (15-25 °C) 45 dakika inkübe edin.
27. Slaytları PBS-T ile 3-5 kez yıkayın.
28. Slaytlardaki sıvıyı çıkarın.
29. Her bölüme bir damla histoloji montaj ortamı ekleyin.
30. Slaytı bir cam kapakla örtün.
31. Floresan mikroskobu kullanarak lekeli slaytların fotoğraflarını çekin.

4. GSIS (glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu testi)

1. Üç farklı çözelti hazırlayın: düşük glikozlu KREBS çözeltisi, yüksek glikozlu KREBS çözeltisi ve KCl'li düşük glikozlu KREBS çözeltisi.
2. Tüm çözeltileri 37 °C su banyosunda ısıtın.
3. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak benzer büyüklükte yaklaşık 10 - 15 kümeyi dikkatlice seçin ve kümelerin kurumasını önlemek için bunları az miktarda farklılaştırılmış ortamla birlikte 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: Kümeler çıplak gözle görülebilmelidir, ancak değilse, kümeleri seçmek ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için farklılaşmış kümeler içeren plakayı ters mikroskop altına yerleştirin.
4. Tüpü kümeler ve ortam ile bir tüp rafına yerleştirin ve kümelerin tüpün dibine batmasını bekleyin.
5. 200 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı yavaşça aspire edin ve 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin.
6. Adacıkları düşük glikoz çözeltisinde 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Deneylerde küme sayılarının ve tutarlılığın doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için, tüpe yapışma eğiliminde olduklarından, aktarım sırasında çözeltideki tüm kümelerin varlığının kontrol edilmesi önerilir.
7. Tüpü inkübatörden çıkarın ve herhangi bir küme aspire etmeden 200 μL KREBS çözeltisini yavaşça aspire edin.
8. 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
9. 200 μL düşük glikozlu KREBS çözeltisinin hacmini 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümleri için hemen -80 °C'de saklayın. Ayrı tedaviler için tekrarlayın.
10. Kümeleri yıkamak için, kümeleri içeren tüpe glikozsuz 200 μL KREBS çözeltisi ekleyin. Kümelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve kümeleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
11. 200 μL yüksek glikozlu KREBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
12. 200 μL yüksek glikozlu KREBS'yi 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümü için hemen -80 °C'de saklayın. Ayrı tedaviler için tekrarlayın.
13. Kümeleri yıkamak için, kümeleri içeren tüpe glikozsuz 200 μL KREBS çözeltisi ekleyin. Kümelerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve kümeleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
14. 200 μL KCl KREBS çözeltisi ekleyin ve ayrı tedaviler için tekrarlayın.
15. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
16. 200 μL KCl KREBS solüsyonunu 500 μL'lik bir tüpe aspire edin ve insülin ölçümleri için hemen -80 °C'de saklayın. Diğer tedaviler için tekrarlayın.
17. 50 μL ultra saf su ekleyin ve toplam insülin içeriğini ölçmeye devam edin.
18. Adacıklar ve ultra saf su ile tüpe 150 μL asit etanol çözeltisi ekleyin.
19. Numuneleri gece boyunca (12 - 15 saat) 4 °C'de saklayın.
20. Ertesi gün, her numuneyi girdaplayın.
21. Adacık dokusunun tamamen parçalanmasını sağlamak için 1 saniye boyunca% 20 güce ayarlanmış bir elektrik sonikatörü ile sonikasyon gerçekleştirin.
    NOT: Görünür küme kalmayana kadar 4.21 adımını yineleyin.
22. Tüm numuneleri 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı saklayın.
23. Daha sonra insülin ölçümlerini normalleştirmek için kullanılabilecek bir nanodrop spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.

Sonuçlar

Bu yazıda açıklanan protokol, β benzeri hücreleri hPSC'lerden¹⁰ ayırt etmek için oldukça verimli bir yaklaşım sunar. Bu süreç, kolayca ölçeklendirilebilen bir 2D kültür sistemi kullanır ve farklılaşmayı öğrenme, daha küçük projeler ve laboratuvarlar ve bir iPSC hattının farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için pilot testler gibi çeşitli deneysel ortamlarda kullanılmasını sağlar.

Glikoz homeostazı hakkında fikir edinmek için a...

Tartışmalar

hPSC'lerin pankreas β hücrelerine başarılı bir şekilde farklılaşması, rutin kültürlemenin ve seçilen hPSC'lerin geçişinin tüm yönlerinin optimize edilmesine bağlıdır. Bu, hücre hattının normal bir karyotipe sahip olmasını, mikoplazma enfeksiyonu için negatif olmasını ve plazmit veya viral vektör genomlarından arınmış olmasını sağlamayı içerir. Ayrıca, hiPSC'leri kullanırken, pilot deneyler için hala yeniden programlanmakta olan en eski pasajı kullanmaktan kaçınmak önemlidir. Bu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750