Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

Özet

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) her tür hücreye farklılaşabilir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerinin mükemmel bir alternatif kaynağı haline getirir. hPSC'ler, blastosistten türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) veya bir yeniden programlama işlemi kullanılarak doğrudan somatik hücrelerden üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler) olabilir. Burada, farklılaşmadan ve daha sonra insülin üreten pankreas hücrelerinin oluşturulmasından önce hPSC'ler için optimal kültür ve geçiş koşullarını ana hatlarıyla belirtmek için video tabanlı bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hPSC'lerin kesin endoderm (DE), ilkel bağırsak tüpü, posterior ön bağırsak kaderi, pankreas progenitörleri, pankreas endokrin progenitörleri ve nihayetinde pankreas β hücrelerine farklılaştığı β hücreye yönelik farklılaşma için altı aşamalı süreci takip eder. Bu farklılaşma metodolojisinin insan pankreas β hücrelerini oluşturmak için 27 günlük bir süre alması dikkat çekicidir. İnsülin sekresyonunun potansiyeli, immün boyama ve glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonunu içeren iki deneyle değerlendirildi.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), çeşitli hücre tiplerine farklılaşma konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir ve bu da onları insan pankreas β hücrelerine uygun bir alternatif haline getirir1. Bu hPSC'ler iki tipe ayrılır: blastosist2'den türetilen embriyonik kök hücreler (hESC'ler) ve somatik hücrelerin doğrudan yeniden programlanmasıyla üretilen indüklenmiş pluripotent hücreler (hiPSC'ler)3. hPSC'leri β hücrelere ayırma tekniklerinin geliştirilmesi, hem temel araştırmalar hem de klinik uygulamalar için önemli etkilere sahiptir 1,4<....

Protokol

Farklılaşmaya başlamadan önce, deneysel amaçlar için gerekli sayıda adacık benzeri organoidin belirlenmesi önerilir. 6 oyuklu bir plakada, %80'in üzerinde birleşmeye sahip tek bir kuyu tipik olarak 2-2,3 milyon hPSC'den oluşur. hPSC hatlarındaki farklılıklar ve farklılaşma verimliliği nedeniyle doğru bir tahmin zor olsa da, kaba bir tahmin, ilk kuyu sayısının 1,5 katıdır. Etkili bir şekilde yönlendirilmiş bir farklılaşma, genellikle altı oyuklu plakalarda oyuk başına 1.6 ila 2 milyon hücre verir ve yalnızca insülin üreten hücrelerden ziyade kümeler içindeki tüm hücreleri kapsar. 50 μm'lik bir küme için, yaklaşık 10.000 hücre içerecek şekilde tahmin edilebilir.

Temsili Sonuçlar

Bu yazıda açıklanan protokol, β benzeri hücreleri hPSC'lerden10 ayırt etmek için oldukça verimli bir yaklaşım sunar. Bu süreç, kolayca ölçeklendirilebilen bir 2D kültür sistemi kullanır ve farklılaşmayı öğrenme, daha küçük projeler ve laboratuvarlar ve bir iPSC hattının farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için pilot testler gibi çeşitli deneysel ortamlarda kullanılmasını sağlar.

Glikoz homeostazı hakkında fikir edinmek için a.......

Tartışmalar

hPSC'lerin pankreas β hücrelerine başarılı bir şekilde farklılaşması, rutin kültürlemenin ve seçilen hPSC'lerin geçişinin tüm yönlerinin optimize edilmesine bağlıdır. Bu, hücre hattının normal bir karyotipe sahip olmasını, mikoplazma enfeksiyonu için negatif olmasını ve plazmit veya viral vektör genomlarından arınmış olmasını sağlamayı içerir. Ayrıca, hiPSC'leri kullanırken, pilot deneyler için hala yeniden programlanmakta olan en eski pasajı kullanmaktan kaçınmak önemlidir. Bu.......

Teşekkürler

Ines Cherkaoui, Araştırmacı Ödülü için Wellcome Trust'a (212625/Z/18/Z), Program hibesi için UKRI MRC'ye (MR/R022259/1), Proje hibesi için Diabetes UK'ye (BDA16/0005485), başlangıç fonları için CRCHUM'a, John R. Evans Lider Ödülü için Innovation Canada'ya (CFI 42649) teşekkür eden GAR'a Diabetes UK öğrenciliği (BDA 18/0005934) tarafından desteklendi. Proje hibesi için NIH-NIDDK (R01DK135268) ve ekip hibesi için CIHR, JDRF (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-SN). Camille Dion ve Dr Harry Leitch, insan hiPSC'lerinin üretimi ve kültürüne yardımları için, NIHR Imperial BRC (Biyomedikal Araştırma Merkezi) Organoid tesisi, Londra.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

Referanslar

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. <....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.